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研究背景胃癌（Gastric cancer,GC）是常见的消化系统恶性肿瘤,目前它是我国第三大常见癌症,死亡率也位居第三位。对于东亚人尤其是中国患者而言,胃癌切除联合D2淋巴结清扫是可切除胃癌的标准治疗方法。但是,胃癌患者即使接受了根治性切除和D2淋巴结清扫术及术后辅助化疗,术后仍有高达57%的局部区域复发率,这可能与胃癌早期的症状不明显,发现时大部分患者已是局部进展期有关。对于可行胃癌根治性切除术+D2淋巴结清扫的局部进展期胃癌（local advanced gastric cancer,LAGC）而言,如何降低术后复发率、提高远期生存期并及早的发现术后的复发转移是目前需要亟待解决的问题。围术期治疗（新辅助化/放疗+手术+辅助化/放疗）在下段食管及食管胃结合部腺癌中的治疗效果在西方国家已证实优于单纯手术。围手术治疗的主要优点是有可能使肿瘤降期,提高R0切除率,且患者术前治疗的耐受性也比术后治疗好得多,从而确保所有患者都能按时接受预期的治疗。迄今为止仅在少数Ⅱ期研究证明了胃癌术前放化疗策略的安全性、耐受性和高病理完全缓解率。对于局部进展期胃癌,术前放化疗在国内开展的研究较少。目前国际多中心的TOPGEAR研究,荷兰的CRITICS-Ⅱ研究以及由中山大学肿瘤中心发起的Neo-CRAG研究正在对胃癌的新辅助放化疗展开积极的探索,目前还没有公布最终的研究结果。由于胃癌术后的复发转移较为隐匿,肿瘤标志物CEA、CA199、CA724和CA125在胃癌术后复发转移监测中的敏感性和特异性较低,传统的影像学（如超声、CT、PET-CT、MRI等）检查对于早期实质脏器的微小转移及腹膜转移等也难以发现,这导致很多患者治疗不及时而失去了最佳的治疗机会。因此,我们需要更精准的生物标志物来预测胃癌术后的早期复发转移及预后。1869年Ashworth首次提出了循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTCs）的概念,它被定义为因自发或诊疗操作由实体瘤或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞,若干个CTC聚集形成簇,即循环肿瘤微栓（circulating tumorcell microemboli,CTM）,它较CTC具有更高的侵袭力,被认为是肿瘤转移最重要的危险先兆。由于CTC检测具有无创性和实时疗效监测等优势,目前国内外多个肿瘤专家共识及相关研究均指出CTC是继CEA、CA199、CA125、AFP、SCC等肿瘤标志物之后的又一项非侵袭性生物标志物,可作为肝癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌及食管癌的早期筛查、治疗反应监测及预后评估的手段之一。由于CTC在外周血中极为罕见,大约每106～107个外周血有核细胞中出现CTC的频率为1个,因此这对CTC的分离和检测灵敏度提出了很高的要求。目前CTC在胃癌中的相关研究主要是基于ISET法和CellSearch系统富集CTC,但是上述方法富集CTC的阳性率及准确性较低,且CTM的检出受到了一定的限制,而CTM的检出可以增加对胃癌术后复发转移的了解,从而有助于后续的诊断和治疗。阴性富集（NE）联合免疫荧光CD45染色以及荧光原位杂交技术（FISH）（NE-imFISH）在CTC富集和鉴定方面具有很高的敏感性和特异性,并可以对富集的CTC进行分子分析等下游研究。通过检索文献我们得知,NE-imFISH技术在胃癌CTC检测中的应用较少,且目前尚未有研究评估CTC对Ⅰ～Ⅲ期胃癌根治术后复发转移及预后的预测作用。本研究的第一部分对可手术的LAGC患者行新辅助调强放疗同步XELOX方案化疗,目的在于观察新辅助同步放化疗对LAGC患者术后肿瘤病理退缩程度、手术切除率、肿瘤分期、术后并发症发生率、术后局部复发率、远期生存及不良反应的影响,以便为LAGC制定最合理的治疗方案。此外,为了探索CTC对胃癌根治术后复发转移及预后的预测作用,在本研究的第二部分采用NE-imFISH法检测胃癌初始治疗前及术后的CTC,目的在于观察CTC在胃癌不同分期中的数量表达情况,研究CTC与胃癌临床病理因素之间的关系及与胃癌术后复发转移及远期生存的相关性,以判断CTC检测能否为胃癌根治术后的复发转移及预后提供诊断依据,以便为胃癌根治术后的随访监测及治疗提供指导。本研究将为LAGC的诊治及胃癌根治术后复发转移及预后的预测提供充分的临床证据,以便为LAGC的诊疗提供合理、及时的治疗方案,最终达到延长患者的生存期的目的。研究目的本研究中对可手术的LAGC行新辅助调强放疗同步XELOX方案化疗,目的在于观察新辅助同步放化疗对LAGC患者术后肿瘤病理退缩程度、手术切除率、肿瘤分期、术后并发症发生率、术后局部复发率、远期生存率及不良反应的影响,以便为LAGC的临床诊治提供指导。研究方法选取自2014年1月1日至2017年3月30日在淄博市中心医院就诊的LAGC患者71例,应用随机数字表法将患者分为两组,其中治疗组36例,对照组35例。治疗组先行新辅助调强放疗（45 Gy/25F/5w）同步XELOX方案化疗2周期,如评估有效后行手术治疗,术后再行XELOX方案化疗4周期。对照组先行手术治疗,术后再行6周期的XELOX方案化疗,具有术后放疗指征者给予辅助调强放疗同步XELOX方案化疗。所有患者均随访满3年。研究结果1.治疗组新辅助同步放化疗效果治疗组有5例（13.9%）达到影像学完全缓解（CR）,23例（63.9%）部分缓解（PR）,4例（11.1%）稳定（SD）,4例（11.1%）疾病进展（PD）。根据Mandard肿瘤消退分级系统进行评价,术后病理结果显示TRG1级5例（13.9%）,TRG2 级8例（22.2%）,TRG3 级 10 例（27.8%）,TRG4 级 7 例（19.4%）,TRG5级6例（16.7%）。32例手术患者有81.3%的患者出现T分期降低,56.3%患者出现N分期降低。多因素COX 比例风险回归分析结果显示TRG分级是影响治疗组总生存期（OS）和无病生存期（DFS）的独立预后因素,其中TRG1-2级（HR=0.468,95%CI:0.020-1.103,P=0.017）的患者能够获得更好的 OS;TRG1-2 级（HR=0.468,95%CI:0.001-0.771,P=0.035）的患者能够获得更好的DFS。2.两组患者手术结果比较治疗组患者的R0手术切除率为87.5%,对照组的62.9%,两组比较有显著统计学差异（χ2=5.361,P=0.021）。3.两组患者术后并发症比较治疗组和对照组的术后并发症主要表现为残胃无力、吻合口出血、吻合口瘘、吻合口狭窄、切口感染和肠梗阻。治疗组和对照组术后并发症的总发生率分别为21.9%和25.7%,两组比较无显著统计学差异（χ2=0.136,P=0.713）。4.两组患者生存时间比较（1）治疗组的1年、2年和3年总生存率分别为86.1%、75.0%和61.1%,对照组的1年、2年和3年总生存率分别为77.1%、65.7%和51.4%,两组患者的OS经Log-rank检验无显著统计学差异（P=0.156）。治疗组的1年、2年和3年无病生存率分别为80.6%、72.2%和55.6%,对照组的1年、2年和3年无病生存率分别为54.3%、48.6%和31.4%,两组患者的DFS经Log-rank检验有显著统计学差异（P=0.013）。（2）多因素COX比例风险回归分析显示Bormann分型、病理分化程度及手术方式是影响OS的独立预后因素。其中Bormann Ⅰ型（HR=0.114,95%CI:0.018-0.743,P=0.023）、病理高分化（HR=0.187,95%CI:0.046-0.756,P=0.019）及R0手术（HR=0.118,95%CI:0.032-0.438,P=0.001）的患者能够获得更好的OS;手术方式是影响DFS的独立预后因素,R0手术（HR=0.151,95%CI:0.047-0.478,P=0.001）的患者能够获得更好的DFS。5.两组患者术后疾病进展模式比较（1）治疗组患者术后的3年局部区域复发率为12.5%,显著低于对照组的37.1%（χ2=5.361,P=0.021）。（2）治疗组患者术后的1年、2年和3年无局部区域复发生存率分别为96.9%、93.8%和87.5%,对照组的1年、2年和3年无局部区域复发生存率分别为80.0%、77.1%和62.9%,两组患者的无局部区域复发生存期（LRFFS）经Log-rank检验有显著统计学差异（P=0.003）（3）治疗组患者术后的1年、2年和3年无远处转移生存率分别为83.3%、77.7%和63.9%,对照组的1年、2年和3年无远处转移生存率分别为94.3%、74.3%和62.9%,两组患者的无远处转移生存期（DFFS）经Log-rank检验无显著统计学差异（P=0.598）。（4）多因素COX 比例风险回归分析显示Bormann分型和手术方式是影响DFFS 的独立预后因素。其中 Bormann Ⅰ 型（HR=0.102,95%CI:0.012-0.878,P=0.038）和 R0 手术（HR=0.118,95%CI:0.030-0.470,P=0.002）的患者可获得更好的DFFS;未发现影响LRFFS的独立预后因素。6.不良反应新辅助同步放化疗相关的不良反应主要包括恶心,呕吐,腹泻,白细胞减少症,贫血,血小板减少症及手足综合征,大多数不良反应表现为Grade1-3级。治疗组和对照组在辅助化疗过程中的主要不良反应大多数是Grade1-3级,未发生威胁生命的的Grade 4-5级不良反应。治疗组和对照组辅助化疗过程中的不良反应发生率经卡方检验均无显著统计学差异（P＞0.05）。研究结论1.新辅助放化疗后肿瘤病理消退程度（TRG）越好的患者预后越好。2.新辅助放化疗提高了 LAGC的R0手术切除率,降低T分期和N分期,没有增加术后并发症发生率。3.新辅助放化疗能降低LAGC的术后局部区域复发率,延长3年无局部区域复发生存期。4.新辅助放化疗延长LAGC的3年DFS。5.多因素分析显示Bormann Ⅰ型、病理高分化及R0切除的患者能够获得更好的OS,R0切除的患者能够获得更好的DFS。6.新辅助同步放化疗治疗LAGC安全性高,不良反应患者可耐受。研究目的目前阴性富集（NE）联合免疫荧光CD45染色以及荧光原位杂交技术（FISH）（NE-imFISH）在胃癌CTC检测中的应用较少,且目前尚未有研究评估CTC对Ⅰ～Ⅲ期胃癌根治术后复发转移及预后的预测作用。本研究主要是应用NE-imFISH技术检测胃癌初始治疗前及术后的CTC,目的在于观察CTC在胃癌治疗前不同分期中的数量表达情况,研究CTC与胃癌临床病理因素之间的关系及与胃癌术后复发转移及远期生存的相关性,以探索CTC检测能否为胃癌根治术后的复发转移及预后提供诊断依据,以便为胃癌根治术后的随访监测及诊治提供指导。研究方法选取自2015年1月5日至2018年3月30日在淄博市中心医院行D2且R0切除的78例胃癌患者作为主要研究对象,同时为了检测CTC对胃癌诊断的敏感性和特异性,我们选取20例无肿瘤病史的健康者作为对照组。胃癌患者在手术和同步放化疗前1天抽血行CTC检测,无术后化疗指征的患者在术后1月抽血行CTC检测,具有术后化疗指征的患者在术后XELOX方案辅助化疗结束后1月抽血行CTC检测,以后患者第1年每3个月,第2年每4个月,第3年每6个月,第4年后每1年复查一次CTC。健康者只行一次CTC检测。研究结果1.胃癌患者和健康对照者CTC检出结果分析20名健康对照者检测到的主要为正常二倍体细胞或白细胞,其中有5例（25%）发现了 CTC（CTC计数分别为1个、1个、1个、2个和3个）。78例胃癌患者初始治疗前有76例（97.4%）患者检测到了 CTC,76例患者每3.2ml血液中检测到CTC的中位数为6（范围1～25）。创建ROC曲线以确定区分胃癌患者与健康者的最佳CTC阈值,当cut-off=2时,该模型诊断胃癌的敏感性为91.0%,特异性为90.0%。2.治疗前CTC检出情况与胃癌患者临床及病理特征的相关性78例胃癌患者中初始治疗前检出CTC＜2的患者为7人,其中Ⅰ期3人（42.9%）,Ⅱ期4人（57.1%）和Ⅲ期0人;检出CTC≥2的患者为71人,Ⅰ期 6 人（8.5%）,Ⅱ期22人（31.0%）和Ⅲ期43人（60.5%）。检出 CTC＜2 和CTC≥2的患者在术前TNM分期的构成上经检验有显著统计学差异（P＜0.001）,其中CTC＜2的患者主要是Ⅰ期胃癌患者,而CTC≥2的患者主要是Ⅱ和Ⅲ期胃癌患者。术前Ⅲ期胃癌患者CTC≥4的检出率为97.7%,显著高于Ⅰ期（22.2%）和Ⅱ期（61.5%）的检出率（P＜0.001）;术前Ⅲ期患者CTC≥5的检出率为95.3%,显著高于Ⅰ期（11.1%）和Ⅱ期（46.1%）的检出率（P＜0.001）。检出CTM的5例患者均为Ⅲ期患者。3.胃癌患者放化疗前后及术前、术后CTC检出情况比较19例接受新辅助放化疗的患者新辅助放化疗前检出CTC≥2的患者为17人（89.5%）,新辅助放化疗结束后检出CTC≥2的患者为1人（5.3%）,新辅助放化疗前后CTC≥2的检出率比较有显著统计学差异（χ2=23.75,P＜0.001）。59例未行新辅助放化疗的患者术前检出CTC≥2的患者为54人（91.5%）,术后检出CTC≥2的患者为3人（5.1%）,术前及术后CTC≥2的检出率比较有显著统计学差异（χ2=84.843,P＜0.001）。4.胃癌术后复发转移率和CTC检出率比较78例胃癌患者的1年、2年和3年影像学上的疾病复发转移率分别为14.1%、21.8%和34.6%。第1年、第2年和第3年CTC≥2的检出率分别为19.2%、29.5%和41.0%。第1年、第2年和第3年影像学复发转移患者CTC≥2的检出率分别为 90.9%、94.1%和 96.3%。5.生存分析（1）所有患者均随访满3年,患者的第1年、第2年和第3年总生存率分别为91.0%、84.6%和71.8%;第1年、第2年和第3年影像学上的无病生存率分别为 85.9%、78.2%和 65.4%。（2）检出CTC≥2的患者第1年、第2年和第3年总生存率分别为81.3%、65.6%和34.3%;检出CTC＜2的患者第1年、第2年和第3年总生存率分别为97.8%、97.8%和97.8%。两组患者的OS经Log-rank检验有显著统计学差异（P＜0.001）。（3）检出CTC≥2的患者第1年、第2年和第3年影像学无病生存率分别为68.8%、50.0%和18.8%;检出CTC＜2的患者第1年、第2年和第3年无病生存率分别为97.8%、97.8%和97.8%。两组患者的DFS经Log-rank检验有显著统计学差异（P＜0.001）。（4）将检出CTC≥2的患者分成2≤CTC＜5和CTC≥5两组。其中2≤CTC＜5组患者的OS显著长于CTC≥5组患者的OS（P＜0.001）;2≤CTC＜5组患者的DFS显著长于CTC≥5组患者的DFS（P＜0.001）。（5）未检出CTM但检出CTC≥2患者的OS显著长于检出CTM患者的OS（P＜0.001）。未检出CTM但检出CTC≥2患者的DFS显著长于检出CTM患者的 DFS（P＜0.001）。（6）检出CTC≥2的患者中位DFSCTC为18.7个月（5.2～72.1个月）,而影像学复发转移患者的中位DFS为24.9个月（6.9～73.5个月）,检出CTC≥2的中位时间比影像学发现胃癌复发转移的中位时间早6.2个月。（7）多因素COX比例风险回归分析显示术后CTC检出数量及术后是否检出CTM是影响胃癌患者OS和DFS的独立预后因素。其中术后检出CTC＜2（HR=0.085,95%CI:0.010-0.735,P=0.025）及术后未检出 CTM（HR=0.007,95%CI:0.001-0.077,P＜0.001）的患者能够获得更好的DFS;术后检出CTC＜2（HR=0.042,95%CI:0.005-0.339,P=0.003）及术后未检出 CTM（HR=0.033,95%CI:0.006-0.178,P＜0.001）的患者能够获得更好的OS。研究结论:1.NE-imFISH技术检测CTC对于诊断胃癌具有较高敏感性和特异性。2.胃癌初始治疗前分期越晚,CTC≥2的检出率和CTC检出数量也越高。3.胃癌新辅助放化疗结束后及术后CTC≥2的检出率显著下降,说明治疗前后CTC的变化可以评估胃癌治疗的疗效。4.随着胃癌术后CTC检出率逐年增高,影像学复发转移率也逐年增高。5.胃癌根治术后检出CTC≥2的患者预后较差,检测到CTC数量越多,尤其是检测到CTM的患者预后越差。6.胃癌术后监测CTC的变化能比影像学能更早发现胃癌术后的复发转移。7.胃癌根治术后检出CTC≥2和检出CTM是患者预后差的独立影响因素。