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研究背景和目的:胃癌是全球第5大肿瘤,在导致死亡的肿瘤中排第3位。对于局部晚期或发生远处转移的患者中位总生存期是10-12个月。化疗仍然是胃癌治疗的基石,化疗有效率低,且化疗不良反应大。对于HER2阳性晚期胃癌,在其常规化疗方案中加入抗HER2药物,明显提高患者的PFS、OS,目前曲妥珠单抗已被批准一线治疗HER2阳性转移性胃腺癌,曲妥珠单抗德鲁替康（DS-8201）被批准为二线治疗。但比起HER2阳性乳腺癌,HER2阳性胃癌被批准的药物相对要少。首先,胃癌是异质性强的实体瘤,药物研发困难;其次,胃作为重要消化吸收器官,与患者生活质量关系密切,所以需要加强胃癌药物治疗方面的研究。我们通过研究联用曲妥珠单抗加强了哪些化疗药物的细胞抑制作用,寻找曲妥珠单抗与化疗药物的最佳优势组合,探讨曲妥珠单抗增强化疗药物效应的机制,我们选择的化疗药物也可作为ADC的候选药物。研究方法:第一部分:从TCGA数据库下载HER2mRNA表达水平和临床数据,得到252例HER2阴性和50例HER2阳性胃癌的数据。在HER2阳性与阴性胃癌中,取|log2（FC）|＞1,-log10（Padj）＞1.30103的基因作为差异表达基因,绘制热图。使用R包STRING进行PPi分析,使用cytoscape对分析结果进行可视化绘图。选择HER2关联的子网络。对于差异表达基因,进行功能富集分析,即GO和KEGG分析。探讨HER2表达与胃癌患者临床病理参数的关系:统计常见临床资料如年龄、性别、肿瘤部位、TNM分期、淋巴结转移和肿瘤浸润深度等在HER2阳性及阴性患者中的差异。在实验室常用的胃癌细胞系,MKN28、MGC803、AGS、NCI-N87、SGC7901中,应用western blot方法检测HER-2蛋白的表达,筛选出HER-2阳性细胞株及阴性细胞株。第二部分:MTT方法测定胃癌常见化疗药物顺铂（cDDP）、氟尿嘧啶（5-Fu）、多西他赛（TXT）、表阿霉素（EPI）对于所筛选细胞株MKN28、SGC7901和NCI-N87的IC50;检测不同浓度下曲妥珠单抗对于细胞株的抑制率。分别以单药药物浓度表阿霉素1μM,顺铂10μM,5-氟尿嘧啶1000 μM,多西他赛5 μM处理MKN28、SGC7901和NCI-N87胃癌细胞株24h,通过抑制率差异判断不同细胞株对化疗药物的敏感性。筛选药物联合应用的优势组合,以每种化疗药物的IC50联合靶向药物曲妥珠单抗（100mg/L）共同处理所筛选细胞株,MTT方法检测抑制率,通过与单用化疗药物的抑制率相比,比较哪种药物与曲妥珠单抗有协同作用。第三部分:在常见的胃癌细胞系MKN28、MGC803、AGS、NCI-N87、SGC7901中应用western blot检测pAkt、AKT、pERK及ERK蛋白的表达。将曲妥珠单抗及表阿霉素处理所筛选细胞株,设4种处理组（对照组,单用表阿霉素组,单用曲妥珠单抗组,曲妥珠单抗联合表阿霉素组）,设3个时间作用点（0h,12h,24h）,Western blot 检测 PI3K/AKT 及 MAPK 通路中关键激酶 pAKT、pERK的表达情况。第四部分:表阿霉素在激发光下能产生可见光,即可以自发荧光,表阿霉素单药、表阿霉素联合赫赛汀分别处理MKN28及NCI-N87 12小时后荧光显微镜检测细胞内表阿霉素积累量的差异。于TCGA数据库应用生物信息分析方法寻找相关耐药靶基因ABCG2。收集临床病例用实时荧光定量PCR进一步验证ABCG2在HER2阳性及阴性胃癌组织中的表达差异。Western blot检测NCI-N87、MKN28、SGC7901 3种细胞株中ABCG2蛋白的表达差异。表阿霉素单药、表阿霉素+赫赛汀、表阿霉素+赫赛汀+740Y-P分别处理HER2阳性NCI-N87细胞株24h检测pAKT、AKT、ABCG2蛋白表达是否有关联性。其中740Y-P是PI3K激活剂。实验结果:第一部分:从TCGA数据库下载HER2mRNA表达水平和临床数据,得到252例HER2阴性和50例HER2阳性胃癌的样本。HER2阳性样本与HER2阴性样本共有1059个差异表达基因,其中包括307个上调差异表达基因和752个下调差异基因。用STRING对1059个差异表达基因进行PPI分析,选择ERBB2关联的子网络图,包括21个上调基因,36个下调基因,其中编码药物转运蛋白的ABCG2基因为其中的上调基因,即随着HER2表达增加而增加。HER2的差异表达基因功能富集分析结果显示,这些基因主要富集于质膜的外侧面、细胞外基质,其主要的分子功能是受体配体活性、信号受体激活剂、一价阳离子跨膜转运体,参与生物学过程为T细胞激活、细胞黏附调节、钙离子内稳态等。从数据库获得胃癌患者中,阳性患者占比16.5%,与国内外研究类似,但患者HER2表达情况与常见临床病理资料如性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期、淋巴结转移和肿瘤浸润深度等无明显关系。我们所用的胃癌细胞系中,相对于其它细胞株,NCI-N87高表达HER2蛋白,SGC7901表达量中等,而MKN28表达量最低。可以选择NCI-N87和SGC7901作为HER2阳性表达胃癌细胞株,MKN28作为HER2阴性表达胃癌细胞株。第二部分:应用MTT方法检测顺铂、5-氟尿嘧啶、多西他赛、表阿霉素对于NCI-N87 胃癌细胞株的单药IC50为 4.08 mg/L,49.45 mg/L,3.00 mg/L,0.76 mg/L;对于 MKN28 胃癌细胞株的单药 IC50 为 3.44 mg/L,146.16 mg/L,2.54 mg/L,0.39 mg/L;对于 SGC7901 胃癌细胞株的单药 IC50 为 3.62mg/L,198.36mg/L,3.23 mg/L,1.05mg/L。单用曲妥珠单抗对于3种胃癌细胞株均无明显抑制作用,高浓度1000mg/L作用于HER2高表达细胞株N87抑制率仅10.12%。HER2阳性细胞株SGC7901和NCI-N87相比于HER2阴性细胞株MKN28在同一浓度表阿霉素处理下抑制率明显不同,有统计学意义（p＜0.05）,认为HER2阳性细胞株存在表阿霉素耐药。在HER2阳性NCI-N87及SGC7901细胞株,曲妥珠单抗联合表阿霉素比单用化疗药抑制率明显增加（p＜0.05）,赫赛汀联合顺铂、赫赛汀联合5-氟尿嘧啶、赫赛汀联合多西他赛比单用化疗药无明显变化。在HER2阴性的M28细胞株,曲妥珠单抗联合4种化疗药物比单用化疗药抑制率未见明显变化。第三部分:5种胃癌细胞系中,HER2阳性胃癌细胞株NCI-N87、SGC7901 pAKT及pERK的表达量明显高于其他3株细胞,有统计学意义（P＜0.05）,认为HER2阳性胃癌细胞中MAPK、PI3K-AKT通路明显活化。在HER2阳性NCI-N87及SGC7901细胞株,曲妥珠单抗单药、曲妥珠单抗联合表阿霉素处理细胞12、24小时后pAKT明显降低（p＜0.05）,在HER2阴性的M28细胞株没有发现这些趋势,提示PI3K/AKT通路可能参与曲妥珠单抗和表阿霉素的协同作用。在HER2阳性细胞株NCI-N87和SGC7901,曲妥珠单抗单药处理细胞24小时后较其他组pERK表达水平明显降低（p＜0.05）,但曲妥珠单抗联合表阿霉素组pERK较对照组未见降低,提示MAPK信号转导通路在曲妥珠单抗和表阿霉素协同作用中未发挥明显作用。第四部分:HER2阴性细胞株MKN28加入赫赛汀后表阿霉素在细胞核积累量无明显变化,而HER2阳性细胞株NCI-N87加入赫赛汀后表阿霉素在细胞核积累量明显上升,有统计学意义（p＜0.05）,单个细胞核的荧光强度明显升高,说明表阿霉素胞内积累量增加,进一步提示可能细胞表面的化疗药物耐药相关转运蛋白活性下降。ABC超家族耐药泵主要成员为ABCB1、ABCC1、ABCG2,通过对TCGA数据库胃癌样本分析发现只有ABCG2在HER2阳性及阴性患者中表达有差异,并且实时荧光定量PCR进一步验证ABCG2在HER2阳性胃癌表达量高于HER2阴性胃癌。因此接下来我们选择ABCG2为靶蛋白研究它参与表阿霉素跨膜转运及赫赛汀靶向治疗的机制。Western blot实验显示HER2阳性细胞株NCI-N87、SGC7901高表达ABCG2蛋白,HER2阴性细胞株MKN28细胞株低表达ABCG2蛋白,有统计学差异（p＜0.05）,与第一部分生信分析中HER2差异表达基因研究结果相同,ABCG2蛋白是HER2相关的上调基因。在药物处理实验中,ABCG2蛋白和pAKT在使用表阿霉素单药时无变化,加用赫赛汀抑制PI3K/AKT通路后同时明显下降,再加用PI3K激活剂740Y-P后ABCG2蛋白和pAKT表达值又同时升高,740Y-P逆转了赫赛汀的作用,说明ABCG2蛋白表达情况与PI3K/AKT通路活性正相关,受PI3K/AKT信号通路相关蛋白的调节。结论 胃癌中HER2的表达与常见临床病理资料如性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期、淋巴结转移和肿瘤浸润深度等无明显关系。但是加用抗HER2药物明显提高化疗药物的抗肿瘤作用。HER2阳性胃癌对表阿霉素表现出耐药。曲妥珠单抗单药治疗,对于HER2阳性N87及SGC7901细胞株无明显抗肿瘤效应。赫赛汀与表阿霉素联合治疗,增强了表阿霉素的细胞抑制率。HER2阳性胃癌MAPK、PI3K-AKT通路异常活化,尤其是PI3K-AKT,二者与肿瘤发生、发展、化疗耐药等相关。通过生信分析研究发现,HER2与ABCG2转运蛋白表达正相关。临床病例组织来源的实时荧光定量PCR进一步验证ABCG2在HER2阳性胃癌表达量高于HER2阴性胃癌。相关机制研究发现,赫赛汀通过抑制PI3K/AKT通路的磷酸化水平减少ABCG2转运蛋白的表达,因ABCG2参与表阿霉素胞外转运,进而减少表阿霉素外排,来增加细胞核内表阿霉素的聚集,最终加强了表阿霉素的细胞毒性。意义:近年来研究HER2的靶向治疗意义重大,首先HER2的异常表达广泛存在于多种实体瘤,新研发的药物可考虑多种肿瘤适应症;其次,由于新型ADC药物的旁观者效应,HER2阳性的范围正在扩大,HER2免疫组化2+不用行FISH便可认定HER2阳性,增加了药物适应症人群。所以有更多癌种更多人群从抗HER2治疗中获益。目前ADC药物的研制方兴未艾,尤其是靶向HER2的药物,我们选择曲妥珠单抗联合化疗药物的优势组合,可以为ADC提供候选药物,来达到更好的治疗效果。胃癌中的研究结果亦可对其他实体肿瘤治疗进行提示,在靶向药物联合化疗的治疗模式中如何进行二者的优化选择,具有潜在的临床指导价值,同时药物联合协同作用的分子机制探讨会对今后的治疗方案设计制定提供新的线索。