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研究背景RAS基因家族编码细胞内信号传导途径中的“下游区”的一种信号传导蛋白,对细胞的生长存活和分化等功能具有重要的影响。RAS突变是人类癌症中最常见的致癌基因之一,其突变频率存在显著差异。RAS家族包含KRAS、HRAS和NRAS三种亚型,其中KRAS突变较其他两种更为常见。KRAS在肿瘤中总的突变比例约30%,其中最常见的有胰腺癌（＞90%）、肺癌（20-30%）、结直肠癌（30-45%）。KRAS 突变率在不同种族的非小细胞肺癌（NSCLC）患者 中存在差异,据报道白种人中KRAS突变率为27%,是白种人NSCLC中突变率最高的驱动基因,而在亚洲人中不足10%。基因突变分析在过去10年中得到了广泛的应用,然而,KRAS突变长期以来被认为是“无药可用”的,KRAS突变的NSCLC患者的治疗方案与无靶向驱动基因突变的NSCLC患者基本相同。由于绝大多数KRAS突变的转移性NSCLC病理类型为腺癌,目前在中国标准一线治疗是培美曲塞联合贝伐珠单抗和/或免疫治疗。2019年,新型KRAS-G12C共价键抑制剂——AMG510开始被报道。随后的试验结果报道AMG510在经治的59名具有KRAS G12C突变的NSCLC中,取得了中位6.8个月的无进展生存（PFS）。基于令人鼓舞的抗癌活性,2021年5月,美国食品药品监督管理局（FDA）批准了 AMG510（Sotorasib）上市,用于治疗经治的具有KRAS G12C突变的转移性NSCLC患者。面对KRAS突变NSCLC患者治疗的新选择,很有必要全面了解中国人群中KRAS突变NSCLC患者的临床病理特点、突变亚型以及现有的一线治疗的疗效。但目前关于亚洲人群KRAS突变NSCLC肺癌患者治疗情况的研究仍然比较缺乏。和所有靶向药物一样,针对KRAS突变的AMG510也不可避免的会出现耐药。已有基础研究显示在治疗后不久,一些癌细胞会处于低KRAS活性的静止状态,而另一些则绕过这种作用恢复增殖。因此与其他治疗手段的联合,提高疗效延缓耐药目前正在火热研究中。放疗作为局部治疗手段,应用普遍,患者可及性高,理论上与AMG510联合应用不存在毒副作用叠加的困扰,目前尚无联合使用的研究报道。虽然存在争议,但是KRAS突变肿瘤存在放疗抵抗很早就被提出,RAS信号的激活已被证明能增加暴露于引起DNA损伤的药物的肿瘤细胞的存活时间。究竟新兴的KRAS抑制剂AMG510能否增加KRAS突变肿瘤的放射敏感性,十分值得期待。放疗具有激活机体免疫的作用。在射线杀伤局部肿瘤细胞的同时,肿瘤相关抗原释放,成熟的树突状细胞吞噬肿瘤抗原并进行肿瘤递呈,介导适应性和固有免疫发挥抗肿瘤作用。进而特异性T细胞免疫应答激活,炎性因子C-X-C基序趋化因子10（CXCL10）、Ⅰ型干扰素（IFN）等表达增加,免疫微环境中免疫细胞表型改变,从而调节免疫微环境。但也有研究显示,放疗的同时会带来一些免疫抑制的不良影响,如对射线敏感的淋巴细胞被杀死,使肿瘤细胞细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）表达增加介导免疫耐受,血管内皮生长因子A（VEGFA）表达增加促进血管生成等。研究已经表明AMG510除了有效抑制肿瘤生长作用的同时,也具有激活机体抗肿瘤免疫的作用。而AMG510与放疗联合后对抗肿瘤免疫功能影响的研究尚未知。根据既往报道的数据推测,中国人群NSCLC患者具有KRAS G12C突变的预测约为3%,远低于西方人群的10%。因此,有望从新型KRAS G12C抑制剂AMG510中获益的患者比例还是有限。因此寻找能够让更多KRAS突变患者获益的治疗方案也是亟需探索的方向。KRAS通路的激活及调节过程十分复杂、多样,具有环境和器官的特异性。是否可以通过靶向KRAS下游的信号分子避开KRAS分型的限制,而达到治疗KRAS突变肿瘤的效果,目前仍在持续探索中。其中,PI3K/PDK1/AKT和RAF/MEK/ERK是最主要的KRAS下游信号转导通路。已上市的MEK抑制剂能否与放疗协同杀伤KRAS突变肿瘤,激活抗肿瘤免疫的作用也尚不可知。研究目的1.通过病例回顾研究,系统地描述了中国KRAS突变NSCLC患者的临床特征、RAS突变亚型、共存突变情况和一线接受培美曲塞联合铂类化疗的疗效。希望通过我们的研究,在临床肿瘤医生为KRAS突变晚期NSCLC制定全程管理策略时,能够提供一些信息参考。2.通过体外实验,研究AMG510与放疗联合对具有KRAS G12C突变的细胞系的影响,探索AMG510是否能够增加肿瘤细胞的放疗敏感性,以及是否能够协同激活免疫增加抗肿瘤治疗效果。3.使用KRAS下游信号通路MEK抑制剂（MEKi）——曲美替尼（Trametinib）,探索联合放疗是否能够协同激活机体抗肿瘤免疫。通过构建两种KRAS突变肿瘤的免疫健全鼠治疗模型,观察联合治疗的疗效,为KRAS突变患者探索新的治疗方案。研究方法1.筛查2016年1月至2020年10月确诊的5180例接受基因检测的NSCLC患者。分析KRAS突变患者的临床特征、KRAS突变类型和共存突变情况。2.通过一项配对研究,比较进展期KRAS突变与KRAS野生型NSCLC患者,一线接受培美曲塞联合铂类的化疗疗效和生存情况。3.收集进展期KRAS突变NSCLC患者的临床病理特征、血液学检查和治疗情况,分析影响患者PFS和总生存期（OS）的预后影响因素。4.使用具有KRAS G12C的人肿瘤细胞系,通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）的方法确定AMG510在不同细胞系的半数抑制浓度（IC50）值,根据IC50值确定合适的克隆形成药物浓度后,探索AMG510的放疗增敏作用。探索AMG510与放疗对细胞周期的影响。5.通过qPCR和Western blot方法检测放疗后PD-L1表达的变化,联合应用AMG510后,通过qPCR、Western blot和流式细胞术检测细胞表达PD-L1的变化。体外激活Jurkat细胞,观察对AMG510、放疗以及联合治疗后的肿瘤细胞的杀伤作用。6.Western blot方法探索AMG510对下游信号通路MEK-ERK的抑制,并与MEKi进行对比,观察对PD-L1降低程度。7.使用具有KRAS突变的小鼠细胞系CT26和LLC,通过Western blot方法检测对下游信号通路的抑制以及对PD-L1表达的影响;通过qPCR方法检测细胞表达细胞因子的变化;通过流式细胞术检测细胞表面PD-L1和Ⅰ型主要组织相容性复合体（MHC）分子的表达。8.构建CT26与BALB/c以及LLC与C57BL/6小鼠移植瘤模型,观察对照组、MEKi组、放疗（RT）组以及联合治疗组的肿瘤生长情况,分析脾脏CD3、CD4、CD8+淋巴细胞的比例,免疫组化分析肿瘤浸润T淋巴细胞,以及PD-L1表达情况。9.小鼠肿瘤送基因测序,分析免疫相关基因转录表达情况。研究结果1.KRAS突变NSCLC患者的临床特征共检出RAS突变477例（9.21%）,总体的KRAS突变率为9.09%（471/5180）。1239例接受突变特异性扩增系统（ARMS）-PCR基因检测的患者中,发现KRAS突变103例（8.31%）,NRAS突变2例。在3941例接受二代测序（NGS）基因检测的患者中,发现368例患者存在KRAS突变（9.33%）,其中1例患者同时存在KRAS和NRAS突变。KRAS突变在有吸烟史和年龄较大的男性患者中更为常见（P＜0.01）。NGS检测出KRAS的三个最常见突变位点分别是G12C（n=106,28.5%）、G12D（n=79,21.1%）和 G12V（n=75,20.2%）。有 215 名 RAS突变患者收集到共存突变信息,发现TP53（n=107,49.8%）和STK11（n=40,18.6%）是最常见的共存突变,不同KRAS突变亚型中共存基因突变发生率不同。EGFR突变,T分期,N分期以及病理类型为腺癌是NSCLC患者初始诊断脑转移的危险因素,而KRAS突变不是脑转移的危险因素。2.KRAS突变NSCLC患者接受培美曲塞联合铂类化疗的疗效筛选出102对KRAS突变及KRAS野生型的初治进展期NSCLC患者,一线接受培美曲塞联合铂类化疗,两组在临床病理特征以及治疗方案选择均衡可比。KRAS突变组的PFS为6.4个月（95%CI 5.1～7.7个月）,与KRAS野生型组相比,差异有统计学意义（9.9月,P=0.045）。但两组的中位OS相比,差异不具有统计学意义（25.4 vs 31.4个月,P=0.105）。3.KRAS突变NSCLC患者PFS和OS的预后因素分析血小板/淋巴细胞比值（PLR）（风险比[HR]=2.38,P=0.019）,联合贝伐珠单抗（HR=0.52,P=0.019）,以及联合免疫治疗（HR=0.30,P=0.004）是KRAS突变患者的PFS独立影响因素;血小板/淋巴细胞比值（PLR）（HR=2.55,P=0.030）,以及联合免疫治疗（HR=0.31,P=0.025）为KRAS突变患者的OS独立影响因素。虽然KRAS G12C亚型患者的PFS最短,只有4.5个月,但并未得到KRAS突变亚型与预后的统计学相关性。4.AMG510不能增加KRAS G12C突变细胞系的放疗敏感性根据克隆形成得到的合适的浓度,探索AMG510对KRAS G12C突变细胞系的放疗敏感性影响。加入AMG510后24小时,对细胞进行放射,结果显示AMG510不能增加miapaca2和H1792的放疗敏感性。调整用药与放疗之间的时间间隔,即加入AMG510后1小时,并增加不同药物浓度组,再次对miapaca2进行不同剂量的照射。结果显示AMG510仍然不能增加细胞的放疗敏感性。细胞周期分析显示,AMG510能够使细胞出现G1停滞,表现为增加细胞周期中G1期的比例,降低G2/M期比例,并随着AMG510浓度增加而增强。5.AMG510能够降低放疗引起的PD-L1的表达放疗能够诱导PD-L1表达,并且随着时间表达量逐渐升高。而AMG510能够降低KRAS突变细胞系PD-L1蛋白水平的表达,也能抑制放疗引起的PD-L1的升高,使用流式细胞术检测细胞表面PD-L1表达与蛋白水平变化趋势一致。6.T细胞对AMG510与放疗作用后的细胞杀伤增强人T淋巴细胞白血病Jurkat细胞,经过植物凝集素（PHA）和佛波酯联合粒细胞集落刺激因子（TPA）激活后,对AMG510或/和放疗处理后miapaca2和H358细胞进行杀伤,发现联合作用后的细胞更容易被Jurkat细胞杀伤。7.AMG510依靠KRAS-MEK-ERK信号通路发挥降低PD-L1的作用我们对AMG510作用24小时后细胞信号通路的影响进行了分析,AMG510能够降低pERK、pAKT、pS6,且随着药物浓度增高而降低明显。但在miapaca2中,pAKT的降低不明显。使用与AMG510相同剂量浓度,MEKi能够有效降低PD-L1的mRNA和蛋白表达,也能够有效降低pERK的表达。考虑到MEK抑制剂不受KRAS突变亚型限制,能为更多地KRAS突变患者所应用,因此我们随后探索了 MEKi与放疗的协同作用。8.MEKi与放疗对具有KRAS突变的小鼠细胞系CT26和LLC的作用MEKi在浓度为10nmol/L和100nmol/L时,均能够有效降低具有KRAS突变的小鼠细胞系CT26和LLC中pERK和PD-L1的表达。MEKi与放疗联合能够协同升高CXCL10和CXCL11基因表达,以及细胞表面的Ⅰ型MHC分子（CT26 表面的 H-2Kd,H-2Dd 和 H-2Ld;LLC 表面的 H-2Kb and H-2Db）表达。此外,MEKi还能够抑制放疗引起的PD-L1的升高。9.在CT26和LLC动物模型中MEKi与RT协同激活抗肿瘤免疫两种动物模型均显示联合使用两种治疗方式的MEKi+RT组的小鼠,肿瘤体积最小,优于单独应用MEKi或RT。生长曲线也显示联合治疗组,能够始终控制肿瘤生长。剥离肿瘤进行称重,也得到同样结论。CT26肿瘤模型中,使用流式细胞术检测发现,MEKi+RT组小鼠的脾脏中CD3+、CD4+、CD8+的T细胞比例均不同程度高于其他组。四组间IFN-γ+T细胞的比例并未发现差异。使用免疫组化（IHC）检测肿瘤中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞浸润情况,结果显示与流式细胞仪检测趋势一致。同样我们检测PD-L1的表达,发现RT组的表达高于MEKi组,而其他组之间未得到统计学差异。LLC肿瘤模型中,使用流式细胞术检测发现,MEKi组与MEKi+RT组的小鼠的脾脏中CD3+、CD4+、CD8+的T细胞比例高于其他两组,对照组和RT组表达比例较低。四组间IFN-γ+T细胞的比例并未发现差异。使用IHC检测肿瘤中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞浸润情况,结果显示与流式细胞仪检测趋势基本一致,MEKi+RT组比MEKi组浸润更加明显。10.MEKi联合放疗更有利于免疫相关信号通路的激活MEKi+RT组与对照组相比,差异表达的基因数目最多,MEKi+RT组的免疫相关的基因表达量更高。结论1.中国NSCLC患者KRAS突变率小于10%。与KRAS野生型组相比,KRAS突变患者一线接受单纯培美曲塞联合铂类化疗的PFS较差。联合免疫治疗可改善KRAS突变肺癌患者接受培美曲塞铂类化疗的预后。2.AMG510不能增加具有KRAS G12C突变的细胞的放疗敏感性。AMG510联合放疗能够有效降低放疗引起的PD-L1升高。AMG510发挥作用主要是通过抑制了 KRAS-MEK-ERK信号通路。经AMG510与放疗联合作用后的肿瘤细胞,更容易被T细胞识别和杀伤,两者联合更有利于激活抗肿瘤免疫。3.MEK抑制剂与放疗联合能够增强抗肿瘤免疫,增加肿瘤T淋巴细胞浸润,抑制肿瘤生长。肿瘤T淋巴细胞浸润增加,可能与细胞因子CXCL10和CXCL11表达升高有关。联合治疗后的肿瘤细胞,Ⅰ型MHC表达增加,PD-L1表达下降,将更有利于浸润的T细胞发挥识别和杀伤作用。本研究探索了 KRAS突变肿瘤的治疗新策略,为将来开展相关的转化研究或者临床试验提供参考。