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研究背景肺癌的发病率逐年增加,是全球范围内最常见的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺恶性肿瘤中最常见的组织学类型,占所有肺癌的85%以上。早期NSCLC的症状和体征并不显著,大多数患者（约40-50%）在就诊时已无法进行手术根治,部分患者已出现肿瘤转移。手术治疗是早期NSCLC患者的首选;对于中后期NSCLC患者,采用多种治疗方法联合的方案。传统的放化疗仍是NSCLC治疗的基石;分子靶向药物治疗在敏感基因突变患者的临床实践中疗效显著;免疫治疗作为NSCLC治疗的新兴力量,也取得了突破性的进展。但由于NSCLC具有生长迅速、浸润性生长、异质性强及容易转移等特点,以及各种治疗手段都有其局限性,治疗最终会出现肿瘤的复发、转移。因此,NSCLC患者的总体生存率仍处于较低水平。NSCLC的发生、发展受到遗传、环境等众多因素的影响,与机体内大量相关基因的形态结构和表达调控改变密切相关。探究NSCLC发生、演进的关键因素和调控机制,进一步寻找能提升肺癌的早期诊断水平、准确判断预后的肿瘤标志物及有效的治疗靶点,对NSCLC的治疗具有重要的理论价值和临床意义。G蛋白调节神经突起生长诱导物1基因（G protein regulated inducer of neurite outgrowth 1,GPRIN1）是一种蛋白质编码基因,其表达产物GPRIN1蛋白由856个氨基酸组成,主要定位于细胞膜及细胞质的囊泡上。GPRIN1蛋白可特异性识别活化后的G蛋白,在细胞生长、增殖、分化等相关信号转导中发挥重要的作用。G蛋白是细胞膜受体与效应蛋白之间进行信号转导的“分子开关”。G蛋白结构及功能的改变可导致细胞的信号传导出现异常,是肺癌、胃癌、乳腺癌、大肠癌等多种肿瘤发生和发展过程中的关键环节。GPRIN1基因或编码形成的GPRIN1蛋白表达异常可导致G蛋白活性调节障碍,与临床上多种疾病相关。根据TCGA基因库RNA序列数据和临床数据分析显示GPRIN1在肺腺癌组织与正常肺组织中差异表达,并且GPRIN1的表达水平与患者的临床病理特征及预后生存密切相关,因此可以推测GPRINI在NSCLC的发病中具有重要作用。目前尚未有关于GPRIN1在NSCLC发病中作用及机制的系统研究。因此,明确GPRIN1在NSCLC中的功能及调控机制,可以为NSCLC的个体化治疗提供新的发展方向。研究目的本研究拟探讨GPRIN1基因在NSCLC中的表达情况,分析其与NSCLC患者临床病理特征及生存、预后的相关性。同时研究GPRIN1基因对NSCLC细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭及上皮间充质转化（EMT）的影响。另外,构建NSCLC裸鼠异种移植瘤模型,检测GPRIN1对裸鼠体内移植瘤生长的影响,进一步探讨其在NSCLC中的作用机制。研究方法第一部分:1、基于前期利用TCGA数据库数据阵列分析获得的GPRIN1基因表达与肺腺癌患者临床特征及生存预后关系相关数据。2、选取100例非小细胞肺癌石蜡包埋组织标本及40例癌旁正常肺组织标本制成组织芯片。3、通过免疫组化染色检测100例NSCLC组织及40例癌旁正常肺组织中GPRIN1的表达情况。4、统计学分析GPRIN1在NSCLC组织及癌旁正常肺组织中的表达差异。5、统计学分析GPRIN1表达与NSCLC患者的年龄、性别、吸烟史、TNM分期、组织分化等临床病理特征的相关性。6、根据NSCLC患者的随访资料,分析GPRIN1表达与患者生存预后之间的相关性。第二部分:1、体外培养人非小细胞肺癌细胞系（A549、NCI-H209、NCI-H460、Calu-1）和正常肺上皮细胞系（BEAS2B）。2、通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（qRT-PCR）检测各组细胞系中GPRIN1基因的表达情况。3、通过免疫印迹实验（Western-blot）检测各组细胞系中GPRIN1蛋白的表达情况。4、构建过表达GPRIN1的细胞系和低表达GPRIN1的细胞系,同时构建阴性对照组。5、通过细胞增殖实验（CCK8）检测敲降或过表达GPRIN1对NSCLC细胞增殖能力的影响。6、通过平板克隆实验检测敲降或过表达GPRIN1对NSCLC细胞克隆形成能力的影响。7、通过Transwell细胞迁移及侵袭实验检测GPRIN1的敲降或过表达对NSCLC细胞迁移及侵袭能力的影响。8、通过Western-blot实验检测GPRIN1对EMT中相关因子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail 蛋白表达的影响。第三部分:1、采用慢病毒载体构建GPRIN1敲除、过表达及其相应对照组的稳定表达细胞株。2、将转染后的A549、Calu-1细胞分别接种各组裸鼠皮下,构建裸鼠皮下成瘤模型。3、每周使用游标卡尺测量并记录各组裸鼠肿瘤长径及短径,计算肿瘤体积;并于裸鼠处死后完整剥取肿瘤进行称重。4、通过免疫组化法检测裸鼠皮下移植瘤中Ki-67蛋白及EMT相关蛋白的表达情况。研究结果第一部分:1、对100例NSCLC组织中GPRIN1蛋白的表达情况进行免疫组化染色分析显示,GPRIN1蛋白主要定位于NSCLC细胞的细胞膜和细胞质中。2、GRPIN1蛋白在100例NSCLC组织中的高表达率为65%（65/100）;在30例正常肺组织中的高表达率为27.5%（11/40）。表明GPRIN1蛋白在NSCLC中的表达水平高于正常的肺组织,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3、GPRIN1蛋白高表达与NSCLC患者的肿瘤分化程度相关（P＜0.05）,与NSCLC患者的性别、年龄、吸烟状况、T分期、N分期、M分期及TNM分期无明显相关性（P＞0.05）。表明GPRIN1表达水平越高,则肿瘤组织分化程度越低。4、GPRIN1蛋白的表达水平升高预示NSCLC患者有较短总生存时间,提示高表达GPRIN1与不良预后相关（P=0.004）。5、单因素Cox回归分析显示:GPRIN1表达水平、N分期、M分期、TNM分期与NSCLC患者的总生存时间密切相关（P＜0.05）,是NSCLC患者的不良预后因素。多因素Cox回归分析显示:GPRIN1表达水平、TNM分期均是NSCLC患者独立不良预后因素（P＜0.05）。第二部分:1、在肺癌细胞系 A549、NCI-H209、NCI-H460 和 Calu-1 中,GPRIN1 的 mRNA表达水平明显高于正常肺上皮细胞系BEAS2B（P＜0.01）。2、用高表达GPRIN1的A549细胞系建立了 GPRIN1基因敲降细胞系,用低表达GPRIN1的Calu-1细胞系构建了 GPRIN1过表达细胞系,同时构建阴性对照组。3、qRT-PCR和Western-blot实验显示:与对照组相比,敲降GPRIN1基因后,A549细胞中GPRIN1的mRNA和蛋白质表达水平降低;过表达GPRIN1基因后,Calu-1细胞中GPRIN1的mRNA和蛋白质表达水平升高（P＜0.01）。4、CCK8细胞增殖实验显示:敲降GPRIN1的A549细胞与对照组相比,增殖速度明显下降（P＜0.01）;过表达GPRIN1后,Calu-1细胞的增殖速度较对照组明显加快（P＜0.01）。5、克隆形成实验显示:敲降GPRIN1组形成的细胞克隆数目较对照组明显减少（P＜0.01）;过表达GPRIN1组形成的细胞克隆数目较对照组增多（P＜0.01）。6、Transwell细胞迁移、侵袭实验显示:敲降GPRIN1后,A549细胞的迁移及侵袭能力较对照组明显降低（P＜0.01）;过表达GPRIN1后,Calu-1细胞迁移及侵袭能力较对照组明显增强,差异具有统计学意义（P＜0.01）。7、Western-blot实验显示:敲降A549细胞中GPRIN1的表达,可显著降低N-cadherin、Vimentin 和 Snail 的表达,而增强 E-cadherin 的表达（P＜0.01）;在过表达GPRIN1的Calu-1细胞中有相反的作用（P＜0.01）。第三部分:1、敲除GPRIN1后裸鼠肿瘤的生长速度较对照组减慢,过表达GPRIN1后裸鼠肿瘤生长速度较对照组加快,差异有统计学意义（P＜0.05）。2、敲除GPRIN1后裸鼠皮下形成肿瘤的重量较对照组降低,过表达GPRIN1后裸鼠皮下肿瘤重量较对照组增加（P＜0.05）。3、敲除GPRIN1后裸鼠肿瘤组织中Ki-67蛋白的表达水平较对照组下降,过表达GPRIN1后肿瘤组织中Ki-67蛋白的表达水平较对照组升高（P＜0.05）。4、敲除GPRIN1后裸鼠肿瘤组织中E-cadherin表达水平较对照组升高,N-cadherin、Snail表达水平较对照组明显降低;过表达GPRIN1后裸鼠肿瘤组织中E-cadherin表达水平较对照组降低,N-cadherin、Snai1蛋白的表达水平较对照组升高,差异有统计学意义（P＜0.05）研究结论1、GPRIN1蛋白在NSCLC组织中表达高于癌旁正常的肺组织。2、GPRIN1蛋白的表达程度与NSCLC患者的组织分化程度相关。3、GPRIN1蛋白表达与NSCLC患者的总生存期相关,可以作为NSCLC预后的独立预测因素。4、GPRIN1基因在NSCLC细胞中表达高于正常的肺上皮细胞。5、GPRIN1高表达可促进NSCLC细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力。6、GPRIN1可通过调节EMT相关因子的表达来参与NSCLC的调控。7、GPRINI高表达可促进裸鼠移植瘤的生长、肿瘤细胞的体内增殖能力及EMT过程。