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乳腺癌是目前女性最常见的恶性肿瘤,其早期诊治、疗效预测及改善预后一直位居肿瘤临床科研人员的研究前沿。为不断提高乳腺癌患者的生存率,我国乳腺癌的疾病管理视角正由传统的降低死亡率向降低复发或达到治愈的综合管理模式过渡。在乳腺癌的综合治疗策略中,新辅助化疗（neoadjuvantchemotherapy,NAC）即手术前系统化疗,改变了乳腺癌的传统治疗模式,已成为早期乳腺癌诊疗的重要组成部分。它在提高手术切除率和保乳率、减少复发、提高肿瘤对化疗药物敏感性等方面具有多重优势。表柔比星在乳腺癌NAC中占据重要作用。值得注意的是,由于与西方人群在种族、遗传背景方面的差异,中国乳腺癌患者NAC方案中表柔比星的应用剂量普遍较低。现阶段,关于表柔比星应用剂量与中国乳腺癌患者NAC疗效的相关性研究较少。此外,NAC后病理完全缓解（pathological complete response,pCR）与乳腺癌分子分型及长期生存密切相关,其已成为公认的评估新辅助疗效的评价指标。但并不是所有乳腺癌患者均能从新辅助化疗中获益,部分患者可能出现病情进展,错失最佳治疗时机。得益于分子生物学技术和影像学技术的蓬勃发展,液体活检技术和多参数MRI在乳腺癌早期筛查、实时监控、治疗反应、判断预后等方面展现了广阔的应用前景。然而,对NAC反应的早期评估和预测仍然是一个巨大的挑战。Prominin蛋白定位于质膜突起部位,包括Prominin 1（PROM1）和Prominin 2（PROM2）,它们均为戊聚糖跨膜家族的关键成员。已有研究证实,PROM1与肿瘤侵袭、迁移和复发密切相关,可作为结肠癌、乳腺癌、胰腺癌等多种实体肿瘤的干细胞标志物。PROM2作为Prominin家族中的第二个成员,与PROM1有着相似的蛋白结构,仅由一个独立的基因编码。前期,课题组通过生物信息学分析发现乳腺癌组织中PROM2表达上调提示预后不佳,患者总生存时间（overall survival,OS）缩短。课题组利用免疫组织化学方法对转移性乳腺癌组织样本进行分析,发现PROM2表达上调的乳腺癌患者无进展生存时间（progression free survival,PFS）明显缩短。此外,一些基因表达谱研究也发现,PROM2在黑色素瘤、肺癌和肾癌等其他肿瘤中表达上调。然而,关于PROM2分子生物学功能及其与乳腺癌新辅助关系的研究较少。因此,有必要进一步阐明PROM2的生物学功能和分子学机制,通过分析PROM2在乳腺癌组织的表达情况与乳腺癌新辅助化疗疗效的相关性,为理解肿瘤特征和发现新的治疗靶点积累理论依据。第1部分以表柔比星为基础的乳腺癌新辅助化疗疗效及早期预测研究背景与目的人表皮生长因子 2 受体（Human epithelial growth factor receptor-2,HER-2）阴性乳腺癌由于缺乏特异性靶点,以表柔比星为代表的蒽环类药物在新辅助化疗中一直占据着重要的地位。但是,受限于表柔比星的心脏毒性和骨髓抑制等毒副作用的担忧,与西方人群相比,中国乳腺癌患者NAC方案中表柔比星的应用剂量往往偏低。此外,并不是所有患者均能从NAC中获益,由于肿瘤的异质性,对NAC反应的早期评估和预测仍然是一个重要的临床课题。本研究旨在考察中国乳腺癌患者应用标准剂量表柔比星为基础的新辅助化疗方案的有效性和安全性。同时,探索血浆循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）基因特征和动态变化、多参数磁共振成像技术在早期预测乳腺癌新辅助化疗疗效方面的价值。方法我们从三个独立的医疗中心回顾性收集自2015年1月至2019年12月接受表柔比星为基础的新辅助化疗并接受随后手术治疗的乳腺癌患者的临床数据。这3家医疗中心分别为安徽医科大学第一附属医院,安徽省立医院和蚌埠医科大学第一附属医院。根据表柔比星使用剂量,患者被分为标准剂量组和低剂量组,低剂量组定义为初始治疗剂量下调10%以上。记录并比较作为主要治疗结果的pCR率和Ⅲ-Ⅳ级毒性反应发生率。此外,我们开展了一项探索性研究,招募接受新辅助化疗的乳腺癌患者,采用包含了 425个基因的靶向二代测序（next-generation sequencing,NGS）技术进行多时间点ctDNA检测,共设置3个检测时间点,分别为基线期、1周期新辅助化疗后和手术前。同时,在基线期、新辅助化疗1周期后和新辅助化疗2周期后对乳腺癌患者进行乳腺MRI-DWI-IVIM显像检查,采集不同治疗时间点乳腺磁共振参数值。通过分析ctDNA突变特征和动态变化、磁共振参数与pCR的相关性,初步评估其预测NAC早期治疗反应的可行性。结果1.标准剂量组的pCR率为41.2%,而低剂量组的pCR率为10.1%（P＜0.001）,差异有统计学意义。在亚组分析中,ER阴性和ER阳性患者组的pCR率分别为32.7%和16.2%（P=0.034）。同时,淋巴结阴性和淋巴结阳性患者的pCR率分别为 32.7%和 16.9%（P=0.045）。2.单因素分析表明 ER状态（HR,2.519;95%CI,1.057-5.988,P=0.037）和表柔比星剂量（HR,6.200;95%CI,2.374-16.193,P＜0.001）可能与 pCR 相关,在多变量分析中,以标准剂量表柔比星为基础化疗的乳腺癌患者（HR,6.925;95%CI,2.537-18.902,P＜0.001）在NAC后更可能获得pCR,剂量分组是独立疗效预测因子。3.在Ⅲ/Ⅳ级毒性反应方面,相较于低剂量表柔比星组,标准剂量组血液学毒性发生率更高,但两个剂量组之间差异无统计学意义。观察到的Ⅲ/Ⅳ级非血液学毒性的发生率低于5%。4.基线的ctDNA不能预测疗效,TP53、ERBB2、PIK3CA是患者血浆中最常见的突变基因。通路富集分析中,PI3K-AKT通路在non-pCR组的富集率最高,HRR通路尤其是BRCA1、BRCA2在pCR组的富集率最高。患者在新辅助化疗1个周期后ctDNA水平急剧下降至零且持续的患者更容易获得pCR。5.多参数MRI成像有助于预测乳腺癌患者新辅助化疗的疗效。先于肿瘤退缩,治疗期间灌注分数（perfusion fraction,f）持续下降提示疗效更好,更容易获得pCR。在第1次化疗后（p=0.049）和第2次化疗后（p＜0.001）,f值在pCR组和non-pCR组均有统计学差异。结论1.标准剂量表柔比星可以提高HER-2阴性乳腺癌患者NAC的pCR率,并且没有发现额外的毒性反应。2.研究证实了基于NGS的ctDNA检测在乳腺癌新辅助化疗早期疗效预测中的可行性和有效性。前瞻性患者队列研究发现,ctDNA在一个新辅助化疗周期后持续清零的患者更容易获得pCR。3.在多参数MRI成像方面,灌注分数f值的下降与pCR密切相关,可以作为早期疗效的潜在预测因子。本研究立足于专业的研究平台和扎实的研究背景,解除了乳腺癌新辅助化疗中表柔比星剂量选择的临床困惑,具有较高的临床转化价值。ctDNA连续检测和多参数MRI技术的相关补充,有助于及早识别乳腺癌患者NAC治疗反应,实现乳腺癌个体化精准治疗。第2部分 PROM2促进乳腺癌细胞干性的研究背景与目的Prominin家族包括PROM1和PROM2,PROM1作为肿瘤干细胞生物标记物,与肿瘤侵袭迁移、药物抵抗和肿瘤复发等密切相关。PROM2是Prominin家族中的第二个成员,与PROM1有着相似的蛋白结构。我们前期已报道,PROM2在转移性乳腺癌组织中表达上调,且与更差的乳腺癌总生存时间相关。但是,它与新辅助化疗疗效的关系及生物学功能尚未阐明。本研究主要是利用公共数据库、两种不同的乳腺癌细胞系和一系列分子生物学实验,探究PROM2对乳腺癌细胞多种生物学行为的影响,并进一步阐述其可能的作用机制,为乳腺癌治疗提供有潜力的新靶点和新视野。材料与方法1.利用公共数据库获取乳腺癌新辅助化疗患者高通量测序数据,分析PROM2表达与新辅助化疗结局的相关性。利用管腔型乳腺癌细胞株MCF-7和T-47D,通过慢病毒包被质粒构建PROM2过表达稳定转染细胞株。通过克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验和流式细胞技术检测PROM2对乳腺癌细胞的体外细胞增殖、迁移和侵袭、细胞周期、细胞凋亡的影响。2.通过已构建PROM2过表达稳定转染细胞株,利用Western blot实验、干细胞成球实验和免疫荧光实验检测PROM2对管腔型乳腺癌细胞的上皮细胞间质转化和干性等生物学功能的影响。应用体外裸鼠荷瘤实验,进一步探讨PROM2表达上调对乳腺癌细胞体内成瘤能力的影响。3.利用生信工具预测PROM2下游靶分子,联合Western blot、免疫共沉淀技术检测PROM2过表达对Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果1.GEO数据库中GSE34138和GSE140494数据集分析表明,PROM2差异表达与乳腺癌新辅助化疗疗效相关,PROM2过表达的乳腺癌患者新辅助化疗疗效不佳。体外实验发现,上调PROM2表达可以促进MCF-7和T-47D乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,细胞周期阻滞于G0/G1期,凋亡明显受抑。2.上调PROM2可以促进MCF-7和T-47D乳腺癌细胞的上皮细胞间质转化和干性特征。体内实验发现,上调PROM2可促进MCF-7乳腺癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力。3.在乳腺癌细胞MCF-7和T-47D中,PROM2可能通过与GSK3β相互作用,激活Wnt/β-catenin信号通路,促进β-catenin向细胞核内转运启动功能调控。结论我们的研究证实了 PROM2具有促进MCF-7和T-47D乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移,抑制凋亡的生物学特征。同时,PROM2表达上调的乳腺癌细胞MCF-7和T-47D可促进乳腺癌细胞上皮细胞间质转化和干性特征,其可能通过与Wnt/β-catenin信号通路相互作用实现生物学功能调控。本研究为乳腺癌新辅助化疗研究开辟了一个新视角,PROM2可作为乳腺癌治疗的潜在靶点,为个体化精准治疗提供理论依据。