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植物如何调整自身状态应对外界非生物胁迫,确保完成其生活周期,是当前的植物科学的研究热点。当前世界面临着人口增长,水资源匮乏以及气候环境恶化等问题,如何在保证作物稳产、高产的情况下降低淡水的消耗,让作物在干旱条件下为人类提供充足的粮食,是人类社会所急需解决的问题,而它们的解决对于人口第一大国的中国来说尤为迫切。因此,寻找植物耐旱的关键基因并研究其作用机理,对于人类提高植物的耐旱性,并通过基因改良培养耐旱高产的作物新品种具有重要意义。本研究从分子生物学角度入手,对植物开展抗旱机制研究。干旱作为逆境环境因素之一,其感知和信号通路十分复杂,为此本研究以胁迫响应激素ABA（abscisic acid,脱落酸）作为研究的突破口。植物在非生物胁迫条件下,存在ABA的大量积累。ABA现已被认为是一个植物在非生物胁迫,特别是干旱胁迫下积累的标志性激素,有多种生理功能,特别是ABA可诱导气孔关闭和抑制气孔开放,减少水分散失,提高植物抗干旱能力。植物的气孔是由保卫细胞组成和控制,开放的气孔,对于植物的光合作用与蒸腾作用均至关重要,是植物体向外界散失水分、排出氧气并吸入二氧化碳的通道,在干旱情况下,脱落酸可以通过减少开放程度以避免过多的水分损失。因此,本课题通过研究植物干旱胁迫响应激素-ABA对植物气孔运动及保卫细胞相关信号通路的调控开展。本实验以拟南芥（Arabidopsis thaliana）的保卫细胞为研究体系,通过考查ABA对保卫细胞的影响,研究植物的抗旱生理。当前ABA对保卫细胞离子通道的影响已经有了明确的结论,如ABA对内向钾离子通道的抑制和对阴离子通道的激活。这些研究已使保卫细胞成为研究植物细胞信号传导的经典模型。本实验基于保卫细胞ABA信号转导模型,在拟南芥保卫细胞蛋白质组数据的基础上,利用保卫细胞大量表达蛋白质编码基因的功能缺失突变体,将它们与野生型一起进行干旱处理及ABA调控气孔运动的实验,从中筛选出对ABA响应较野生型更为敏感的突变体,并作为后续研究对象。在此基础上,系统探究ABA敏感突变体对应基因在介导干旱和ABA调控气孔运动中的确切生理功能和分子机理,为进一步揭示植物的抗逆生理提出新的研究思路。具体的研究内容包括以下几个方面:1.突变体的筛选和其抗旱相关性状的研究:通过气孔运动实验,筛选出一个T-DNA插入突变株系SALK016954,它表现出在气孔运动上对ABA较野生型更为敏感的性状。这个突变体是WRKY1基因不能正常的转录,因此,该突变体是WRKY1的功能缺失突变体,我们将它命名为wrky1。为进一步确认是这个基因的突变造成了这一性状,又构建了用其自身启动子驱动该基因表达的功能恢复突变体,发现wrky1突变体的ABA过敏感在功能恢复突变体中得到恢复,由此表明WRKY1参与了ABA对气孔运动的调控过程。为进一步验证wrky1突变体气孔运动对ABA的过敏感,会使其叶片水分散失较野生型和恢复突变体减少,因此,设计开展了离体叶片失水率测定,实验结果与设想相符合。由于气孔的关闭会降低蒸腾作用中水分的散失,这表明该突变体wrky1相较于野生型可能有更好的抗旱性能。通过土壤盆栽干旱控水实验也证明了相较于野生型与恢复突变体,wrky1突变体的抗旱能力得到了显著的增强。为进一步研究WRKY1的生理功能,后续实验考查了该基因在拟南芥的组织定位表达模式和在不同条件下的诱导表达状况,通过构建由该基因自身启动子驱动的GUS质粒,将其转入野生型拟南芥中,经GUS染色以确定这个基因在拟南芥的各组织表达状况。实验结果表明WRKY1基因在拟南芥各部位都有较高表达,特别是对叶片下表皮的GUS染色表明该基因在保卫细胞上存在特异的表达,这与前期的蛋白质组学数据中该基因编码蛋白在保卫细胞的高表达相一致,这个结果也与网上的基因芯片数据（详见http://bbc.botany.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi Electronic Fluorescent Protein Browser（eFP））相吻合。为了进一步确认该基因的组织定位表达,通过采集拟南芥不同组织部位的材料提取总RNA进行RT-PCR,结果显示WRKY1在各组织中都能表达。此外,叶片中WRKY1的表达受干旱和ABA的调控。在干旱和ABA处理条件下,2小时内WRKY1表达受到抑制.但在第3小时和4小时后,ABA条件下的WRKY1表达又恢复到原来状况（但仍略低于对照）,在干旱条件下WRKY1在第3小时到第4小时表达量反弹并升高到原先的1.5倍左右。这些实验数据都提示干旱和ABA都能调控WRKY1基因转录水平的表达,特别是短期（1小时）会抑制该基因的转录。2.保卫细胞的电生理记录与WRKY1转录因子的功能分析先前对保卫细胞的研究发现,在气孔运动的过程中,保卫细胞上的离子通道起着重要的作用。ABA可以抑制保卫细胞上的钾离子通道,降低内向的钾离子电流从而抑制气孔的开放;并且ABA也可以激活外向的阴离子通道,以促使保卫细胞中阴离子外流,降低保卫细胞的膨压,诱导气孔的关闭。本论文采用膜片钳的全细胞记录模式,记录了 wrky1突变保卫细胞的钾离子和阴离子电流,发现突变体wrky1的电流在外施ABA的条件下,表现出比野生型和恢复突变体更为敏感的表型,即内向钾离子电流变的更小而外向阴离子电流变得更大。这与前面的气孔运动实验相一致,说明WRKY1会负调控这些离子通道对ABA的响应。WRKY1基因属于植物特有的WRKY转录因子家族。为确认WRKY1的功能和可能的作用机制,本论文设计了以下实验:首先构建了 WRKY1-GFP的瞬时融合表达载体,并转化拟南芥叶肉细胞原生质体,通过共聚焦显微境的观察确认WRKY1的亚细胞定位,结果显示其在细胞核定位表达,这与它的转录因子身份相符合,即转录因子在细胞核中与DNA结合对基因表达进行调控。WRKY1转录因子属于WRKY家族第一亚家族,其序列典型的特征就是含有两个保守的WRKY结构域。为了确认WRKY转录因子的活性,采用酵母单杂实验确认WRKY1的转录活性和所需要功能的转录结构域。实验表明,其上的两个WRKY结构域都是转录活性所必需的。已有研究表明,WRKY1可与一个称为W-box的顺式元件结合并调控下游基因。通过筛选拟南芥与ABA信号和抗旱相关的多个关键功能基因,发现大多基因上游都存在W-box元件序列。进一步实验选择4个与ABA和抗旱相关的基因（DREB1A,ABI5,MYB2和ABCG40）进行WRKY1转录调控分析。Real-time PCR实验发现在突变体的幼苗中,这四个基因的表达量相较于野生型和恢复突变有显著的差异,其中除ABI5表达显著降低外,其作的三个基因表达量明显高于野生型和恢复突变体。分析它们上游的启动子序列,发现它们都有W-box元件。体外的EMSA实验表明WRKY1转录因子都能与这些基因上游启动子序列结合,ChIP实验表明这种结合在体内仍然存在。综上所述,WRKY1转录因子在正常情况下负调控保卫细胞中的离子通道,使保卫细胞对ABA的敏感性维持在一定水平下;而突变体由于WRKY1的缺失,使保卫细胞对ABA更为敏感。这种高度的敏感伴随着离子通道对ABA敏感性的增加。ABA的高度敏感也解释了突变体的抗旱能力的增强与气孔对水分散失的限制有关。除此以外,WRKY1作为转录因子也参与调节了其它相关基因的调控。实验证实至少有四个基因（ABI5,ABCG40,MYB2和DREB1A）是受到WRKY1转录因子的调控。这四个基因都于干旱和ABA相关,其中ABCG40,MYB2和DREB1A三个基因的表达量都有所增高。这三个基因中,ABCG40负责ABA向保卫细胞内部的转运,它的高表达有助于增强保卫细胞中ABA信号敏感性,MYB2基因的高表达可以提高植株对ABA的敏感性,DREB1A的高表达能增强植物的抗旱能力（信号通路独立于ABA）;有研究表明基因ABI5则表达量下降与抗旱能力的提高相关。这些研究说明了在干旱效应下,WRKY1通过复杂的转录调控网络,调控相关基因的表达从而影响植物的对干旱的响应。本论文还做了在拟南芥中异源表达了玉米丙酮酸转运体家族的ZmNRGA1基因,,通过异源表达的表型分析,进一步证明了丙酮酸转运体与拟南芥抗旱有相关性。