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研究背景全球范围内膀胱癌发病率逐年升高,75%的膀胱癌初诊时为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC）,30%的 NMIBC 随着时间推移会进展为肌层浸润性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer,MIBC）,10%的MIBC诊断时即伴有局部或远处转移。对于MIBC行根治性膀胱切除（radical cystectomy,RC）能够提高部分患者的五年生存率,但仍有50%的患者会出现肿瘤特异性死亡。肿瘤的发生、局部浸润和早期转移与细胞异常增殖、迁移及侵袭等细胞生物学特征有关,而这些生物学特征往往受到某些激酶信号通路调控,因此,发现并证实与膀胱癌发生发展相关的信号通路,进而明确某种能够反映膀胱癌细胞增殖程度的分子学标志物,可为临床膀胱癌分子生物学诊断和潜在治疗靶点选择提供重要参考。胸苷激酶（Thymidine Kinase,TK）是DNA补救合成过程中的关键酶和限速酶,哺乳动物中TK有两种,即细胞质胸苷激酶（thymidine kinase1,TK1）和线粒体胸苷激酶（Thymidine Kinase2,TK2）。组织中的TK1释放到血液中可通过外周血被检测到,称为血清细胞质胸苷激酶（Serum thymidine kinase 1,STK1）。TK1能够催化胸苷（thymidine deoxyribose,TdR）磷酸化为胸苷酸（deoxythymidine monophosphate,dTMP）,dTMP 是合成 DNA 的四种必需核苷酸之一。已有研究证实TK1在乳腺癌、甲状腺癌等多种实体肿瘤中明显高表达,Steffen Rusch等人通过研究发现,浸润性膀胱癌中TK1表达明显高于正常尿路上皮,并提出TK1具有作为膀胱癌诊断标志物的潜力,但关于TK1在膀胱癌发生发展中的具体作用机制至今未见报道。本研究旨在验证TK1在膀胱癌中的作用并进一步明确其发挥作用的分子机制。通过对TCGA和STRING数据库进行分析发现,TK1基因与TFDP1（Transcription factor Dp-1,TFDP1）基因存在相互作用。TFDP1 是一种转录因子,它可以编码DP1蛋白,已有研究证实TFDP1通过Wnt/β-catenin通路在乳腺癌、肝细胞癌和肺癌中起促癌作用。Wnt/β-catenin为经典的wnt信号通路,Wnt信号通路是一种进化保守的与肿瘤发生相关的通路,调节着干细胞自我更新和分化等各种细胞活动,Wnt信号通路的激活与许多肿瘤的发生、发展、分化以及耐药性相关,有研究报道Wnt信号通路的激活与神经母细胞瘤、骨肉瘤等的增殖密切相关。近年来的研究证实Wnt/β-catenin信号通路在膀胱癌的发生发展中扮演重要角色,据此提出TFDP1通过Wnt/β-catenin通路在膀胱癌中发挥作用,TK1通过TFDP1调控Wnt/β-catenin信号通路的假设,但截至目前尚无相关实验研究报道。鉴于此,我们对TK1、TFDP1及β-catenin在膀胱癌中的调控关系进行了研究。第一部分 TK1在膀胱癌中的表达及临床意义研究目的探究TK1在膀胱癌患者及健康人群中的表达特点及其作为膀胱癌增殖相关标志物的可行性。研究方法研究对象为2015年1月到2018年6月,在我院泌尿外科行手术切除的膀胱癌患者。选取随访资料完整的膀胱尿路上皮癌（Bladder urothelial carcinoma,BUC）患者60例。另选取60例我院体检中心的健康体检者作为对照组。手术组患者于术前3天及术后1周、术后3个月、术后6个月随诊或回院行膀胱灌注时抽空腹血检测TK1表达情况;健康对照组仅统计单次空腹血TK1表达情况。采用免疫印迹增强化学发光法检测各组血清TK1的浓度并统计TK1表达阳性率;采用组织免疫组化检测切除标本中TK1与传统肿瘤增殖标志物Ki-67、MCM2、MTA2、PCNA的表达情况。数据的统计分析采用SPSS21.0（部分数据采用SPSS26.0）软件进行统计,计数资料用百分比表示,采用χ2检验,计量资料表示为均数±标准差（x±s）,采用配对的t检验或者两独立样本t检验,组间均数的两两比较采用方差分析,对失访数据进行删失处理,单因素重复测量数据分析采用单因素重复测量方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。研究结果1.BUC患者组血清TK1阳性检出率显著高于健康对照组（78.33%vs 21.67%,P＜0.01）,且检出血清TK1的浓度显著高于健康对照组（3.08±1.51 pmol/l vs 1.34±0.99 pmol/1,P＜0.01）。2.BUC患者术后第1周血清TK1浓度短暂升高,术后第3个月降至阴性表达水平。3.ROC曲线分析预测血清TK1检测BUC的曲线下面积为0.787,95%置信区间为（0.692,0.882）。4.血清 TK1 的表达与 BUC 分期（2.65±1.65 pmol/1 vs 3.35±1.39 pmol/l,P=0.082）及分级（3.05±1.37 pmol/1 vs 3.04±1.59 pmol/1,P=0.981）未发现显著相关性。5.TK1在BUC术后组织标本中的强阳性表达率明显高于Ki-67、MCM2、MTA2及 PCNA（P＜0.01）。研究结论TK1在膀胱癌患者中显著高表达,是膀胱癌相关的肿瘤标志物,对膀胱癌具有潜在的诊断价值。第二部分 TK1与TFDP1相关性的生物信息学分析研究目的运用生物信息学分析的方法分析TK1在膀胱癌及癌旁组织中的表达情况,探讨该基因所富集的通路及其共表达基因,为深入探究TK1的作用机制提供线索。研究方法1.通过TCGA、GTEx及CCLE数据库数据进行TK1单基因多维度泛癌分析。2.对TCGA中膀胱癌与癌旁组织数据进行差异mRNA分析、差异基因分析、TK1差异表达分析并验证TK1与膀胱癌分期分级的相关性。3.通过Hiplot平台分析TK1差异表达得到的TK1-High上调基因,并构建蛋白质互作网络,进一步通过该平台对TK1与TFDP1基因表达量进行相关性分析。4.通过对GEO及Array Express数据库文件进行分析,验证TK1与TFDP1的相关性、TK1富集通路情况、通路相关基因富集情况以及TK1参与细胞周期调控的方式。研究结果1.泛癌分析显示TK1在膀胱癌中高表达。2.414例膀胱癌组织样本和19例膀胱癌癌旁正常组织样本的mRNA表达数据进行差异表达分析,证实膀胱癌中TK1基因表达上调。3.膀胱癌样本中TK1基因表达明显高于癌旁,且TK1在不同分期的膀胱癌中稳定表达。4.在TK1-High组和TK1-Low组之间进行差异表达分析,结果显示:TFDP1在TK1-High组中上调。PPI网络分析及TFDP1、TK1的基因表达量相关性分析提示TK1和TFDP1具有高度相关性,皮尔森相关系数为0.39,R值为1.41,P值＜0.001,95%CI（0.3,0.47）5.GEO、Array Express数据库中膀胱癌细胞系5637及T24中的共表达基因分析显示TK1与TFDP1在膀胱癌细胞系中共表达。6.膀胱癌细胞主要的三个富集通路为嘌呤、嘧啶及细胞周期通路;TK1是重要的嘧啶代谢通路相关基因,TFDP1是重要的细胞周期通路相关基因;通路相关基因富集分析提示TK1有可能是通过TFDP1参与膀胱癌细胞周期调控。研究结论1.TK1和TFDP1的表达存在相关性和蛋白相互作用。2.TK1是重要的嘧啶代谢通路相关基因,TFDP1是重要的细胞周期通路相关基因。第三部分TK1对膀胱癌细胞生物学行为的影响及TK1-TFDP1-Wnt/β-catenin作用通路研究研究目的1.探讨TK1在不同膀胱癌细胞系中表达水平的差异,以及TK1过表达及敲低对膀胱癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等生物学行为的影响;2.探究膀胱癌细胞系中TK1、TFDP1与Wnt/β-catenin通路之间的关系;研究方法1.TK1基因在不同膀胱癌细胞系中的表达水平检测:复苏并扩增培养T24、5637、J82、EJ、RT112五株膀胱癌细胞,RT-PCR、Western blot检测上述五株细胞中TK1基因的mRNA及蛋白表达水平。根据预实验结果选择TK1 mRNA及蛋白高表达的膀胱癌细胞系敲低TK1,选择TK1 mRNA及蛋白低表达的膀胱癌细胞系过表达TK1;2.TK1基因过表达与敲低效果监测:构建TK1过表达慢病毒,用其感染膀胱癌细胞,RT-PCR、Western blot检测TK1的过表达情况,以确认过表达效果。设计合成TK1基因siRNA,用其转染膀胱癌细胞,RT-PCR、Western blot检测TK1表达水平的变化,选择最佳敲低效果的siRNA进行后续实验;3.TK1、TFDP1对β-catenin通路调控关系探究:膀胱癌细胞TK1敲低及过表达后检测其对TFDP1及β-catenin表达水平的影响,膀胱癌细胞TFDP1敲低及过表达后观察其对β-catenin表达的影响,并通过挽救实验验证TK1、TFDP1及β-catenin的调控关系;4.TK1与TFDP1 蛋白相互作用检测:通过免疫共沉淀（Co-inmunoprecipitation,CO-IP）技术免疫沉淀 TK1-TFDP1 复合物,Western blot验证TK1与TFDP1蛋白之间的相互作用关系。5.TK1过表达及敲低对膀胱癌细胞系生物学行为影响检测:各组膀胱癌细胞过表达及敲低TK1后,CCK8检测细胞增殖曲线的变化;流式细胞仪检测对各组细胞凋亡及细胞周期的影响;Transwell检测各组细胞的迁移及侵袭能力的变化;6.TK1与TFDP1相互作用对膀胱癌细胞系生物学行为的影响检测:膀胱癌细胞TK1过表达、TFDP1敲低后,CCK8检测对细胞增殖曲线的变化;流式细胞仪检测对各组细胞凋亡及细胞周期的影响;应用Transwell检测各组细胞的迁移及侵袭能力的变化;7.TK1过表达及敲低对膀胱癌细胞系生物学行为的影响的体内实验:选用4-6周龄裸鼠,接种经TK1过表达及敲低后呈对数生长期的膀胱癌细胞,5-7天后开始观察肿瘤增殖情况,记录测量的最大径线（a）以及最小径线（b）,每周记录2次,制作肿瘤增殖曲线,观察肿瘤成瘤情况,实验结束脱颈处死裸鼠后,瘤体称重计数,HE染色观察组织形态,免疫组化检测各肿瘤组织中TFDP1及β-catenin的表达情况,提取肿瘤组织蛋白及mRNA检测TK1表达情况。8.统计学分析:使用GraphPad Prism 6软件进行统计学分析。每个结果显示为三个独立实验的平均值±标准差（X±SD,n=3）;通过student t检验（Student’s t test）分析比较两组的差异;通过单向方差（ANOVA）分析,然后通过Bonferroni分析,评估多组比较的统计显著性;两组之间的相关性通过Pearson的相关性分析进行评估,P＜0.05具有统计学意义。研究结果1.T24细胞系中TK1mRNA及蛋白表达水平明显高于5637细胞（P＜0.001）。经RT-PCR及Western blot证实TK1过表达后可上调TK1 mRNA及蛋白表达水平,而TK1敲低后可明显下调TK1 mRNA及蛋白表达水平。2.TK1过表达时可上调TFDP1及β-catenin mRNA、蛋白表达水平,TK1敲低后可抑制TFDP1及β-catenin mRNA及蛋白表达水平（P＜0.001）;挽救实验验证了 TK1通过TFDP1的表达调控β-catenin,进而参与Wnt/β-catenin通路调控。3.CO-IP结果提示:分别使用anti-IgG抗体、anti-TK1抗体进行富集,可以同时富集到TK1与TFDP1;通过anti-IgG抗体、anti-TFDP1抗体进行反向富集验证实验,同样可以同时富集到TFDP1与TK1。4.TK1过表达对膀胱癌细胞增殖有明显促进作用,而TK1敲低可明显减弱膀胱癌细胞增殖活动（P＜0.001）,TK1过表达或敲低可导致S期及G2/M期细胞数目发生变化:膀胱癌细胞TK1过表达后,S期细胞数目减少,G2/M期细胞数目增多;膀胱癌细胞TK1敲低后,S期细胞数目增加,G2/M期细胞数目减少,但TK1过表达或敲低对膀胱癌细胞凋亡、迁移及侵袭能力无明显影响。5.敲低TFDP1可明显抑制TK1过表达导致的膀胱癌细胞增殖,使得细胞周期中S期细胞数目增多,G2/M期细胞数量减少,但敲低TFDP1对膀胱癌细胞凋亡、迁移及侵袭能力无明显影响。6.成瘤实验结果提示:TK1过表达后可明显促进膀胱癌细胞增殖,TK1敲低后可明显抑制膀胱癌细胞增殖;TK1敲低后可明显抑制膀胱癌细胞中TFDP1及β-catenin的表达水平;TK1过表达后可明显促进膀胱癌细胞中TFDP1及β-catenin的表达水平。研究结论1.TK1通过调控细胞周期促进膀胱癌细胞的增殖。2.TK1对TFDP1和β-catenin蛋白的表达具有调控作用。3.TK1与TFDP1蛋白相互作用调控下游Wnt/β-catenin信号通路,从而发挥促进膀胱癌增殖的作用。意义本文先经临床病例研究发现,TK1在膀胱癌患者中高表达,对膀胱癌具有一定的诊断价值,是潜在的膀胱癌增殖相关标志物。为验证TK1与癌症尤其是与膀胱癌的关系,经TK1单基因多维度泛癌分析证实TK1是很好的泛癌标志物,也是很好的膀胱癌标志物;通过TCGA、GEO、Array Express数据库应用生物信息学分析手段对膀胱癌差异表达基因进行分析,发现TK1在膀胱癌中显著高表达,TK1和TFDP1存在相关性;通过共表达基因分析及蛋白互作网络构建推断出TK1与TFDP1存在蛋白相互作用关系,并发现TK1、TFDP1与细胞增殖通路相关联的证据。进一步通过分子生物学实验、免疫共沉淀实验、细胞功能学实验及动物实验,探究了 TK1、TFDP1与膀胱癌细胞表型的关系,明确了 TK1与TFDP1之间的相互作用关系,明确了 TK1、TFDP1与Wnt通路蛋白β-catenin之间的调控关系。从而得出结论:（1）TK1可以通过调控细胞周期促进膀胱癌细胞增殖;（2）TK1与TFDP1蛋白相互作用影响下游Wnt/β-catenin信号通路,促进膀胱癌细胞增殖。本研究的意义在于阐明了 TK1参与细胞周期调控、促进膀胱癌细胞增殖的通路机制,为临床膀胱癌的诊断和治疗提供了分子标志物和治疗的潜在靶点。