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研究背景与研究目的近年来我国癌症发病率和死亡率逐年提高,已经成为不可忽视的社会问题。肿瘤免疫治疗通过激活人体自身的免疫系统来杀死肿瘤细胞,为很多癌症患者带来了希望。在肿瘤发展过程中,肿瘤细胞往往在质膜表面上调特定蛋白的表达,这些蛋白与免疫细胞质膜蛋白结合,抑制免疫细胞对肿瘤的杀伤,发生免疫逃逸。这些抑制免疫系统功能的蛋白被称为免疫检查点,是肿瘤免疫治疗的重要靶标。免疫检查点PD-1及其配体PD-L1的抑制剂已经被用于多种癌症的治疗,取得了很大的成功。然而,PD-L1/PD-1疗法的有效率只有10%-40%。其中,肺癌的响应率只有20%左右。如何进一步提高PD-L1/PD-1疗法的响应率,使更多的患者从中获益,是目前面临的一大挑战。PD-L1在肿瘤细胞、树突状细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等多种细胞中高表达。肿瘤细胞中PD-L1高表达与患者不良预后相关。肿瘤细胞PD-L.1高表达是影响PD-L1/PD-1抑制剂效果的重要因素,因此,了解PD-L1表达调控的分子机制有助于提高PD-L1/PD-1疗法的效果。PD-L1的调控可以在基因水平、转录水平、转录后水平、翻译后水平等多个层面发生。在翻译后修饰方面,已经报道有糖基化、磷酸化、泛素化、棕榈酰化、乙酰化等多种修饰,这些修饰影响PD-L1蛋白水平和定位等。目前,PD-L1调控机制了解的还不够清楚。所以,需要进一步研究并完善其调控网络。泛素-蛋白酶体途径是细胞内蛋白降解的主要途径之一。泛素连接酶催化底物发生泛素化,促进底物通过蛋白酶体降解。去泛素化酶降低底物的泛素化,抑制底物蛋白降解,提高蛋白的稳定性。USP22是USP家族的去泛素化酶,最初发现作为转录共激活复合物SAGA的组分,调控组蛋白的单泛素化,从而影响基因的表达。后来发现USP22可以单独去除细胞核和细胞质蛋白的多聚泛素化,并影响蛋白的稳定性。USP22在细胞周期、端粒稳定、细胞凋亡、信号转导等过程中发挥重要作用,被认为是一个促癌基因。研究表明USP22高表达与病人不良预后和肿瘤转移相关。COP9信号复合体（COP9signalosome,CSN）是一个在动物和植物等真核生物中高度保守的蛋白复合物。COP9信号复合体有8个成分,CSN1-CSN8,CSN5是其中一个成分。CSN5含有MPN结构域,其中包含JAMM基序,拥有异肽酶活性,能去除Cullin E3泛素连接酶的neddylation修饰,从而抑制Cullin E3泛素连接酶活性。同时,CSN5也可以水解底物的泛素化修饰,对底物去泛素化,增强蛋白的稳定性。已报道PD-L1是CSN5的底物蛋白,CSN5降低PD-L1的多聚泛素化,稳定PD-L1蛋白,影响抗肿瘤免疫反应。CSN5的结合蛋白有很多,既能提高一些蛋白的稳定性,也能降低某些蛋白的稳定性。所以,CSN5的作用机制比较复杂,需要进一步研究。本论文的研究目的是发现调控PD-L1的新因子,并阐明该调控因子影响PD-L1的分子机制,探究其对PD-L1功能的影响,最终为肿瘤免疫治疗提供新靶标。拟解决的科学问题（1）USP22调控PD-L1的分子机制（2）USP22与CSN5在调控PD-L1过程中的关系（3）USP22对PD-L1的调控是否影响机体免疫系统的抗肿瘤免疫反应研究内容肿瘤细胞中USP22与PD-L1存在相互作用。检索数据库发现,USP22可能是PD-L1的相互作用蛋白。免疫共沉淀实验证明USP22能与PD-L1结合。同时,.分段结构域结合实验显示,USP22与PD-L1的胞内段结构域结合,而PD-L1与USP22的催化结构域结合。免疫荧光实验证明,USP22与PD-L1在细胞质具有共定位。肿瘤细胞中USP22调控PD-L1蛋白水平。敲低USP22并不影响PD-L1 mRNA水平。免疫印迹实验表明,敲低USP22下调PD-L1蛋白水平,过表达USP22上调PD-L1蛋白水平。进一步研究发现,USP22调控PD-L1蛋白的稳定性,而且敲低USP22引起PD-L1通过蛋白酶体途径降解。肿瘤细胞中USP22通过其去泛素化酶活性调控胞内段PD-L1泛素化水平,进而调控PD-L1蛋白水平。免疫共沉淀实验显示,过表达USP22降低PD-L1多聚泛素化,敲低USP22增强了 PD-L1多聚泛素化。USP22去泛素化酶的活性位点突变后失去了下调PD-L1多聚泛素化的能力。USP22降低PD-L1 K6、K11、K27、K29、K33、K63连接的泛素链,而不能去除K48连接的泛素链。PD-L1胞内段结构域有5个赖氨酸,将它们全部突变为精氨酸,用该突变质粒研究USP22对PD-L1去泛素化的作用。结果表明,敲低USP22不能调控突变PD-L1蛋白水平。肿瘤细胞中USP22可能调控内质网中的PD-L1。已报道内质网相关降解（ERAD）过程的E3泛素连接酶HRD1对PD-L1进行泛素化并影响其降解。本论文实验表明,USP22抑制了 HRD1引起的PD-L1多聚泛素化的上升。同时,USP22缓解HRD1引起的PD-L1蛋白水平的下降。肿瘤细胞中PD-L1的糖基化并不影响USP22对PD-L1的去泛素化修饰。文献报道PD-L1的糖基化修饰会抑制PD-L1的泛素化并稳定PD-L1。突变PD-L1的糖基化位点,发现USP22降低糖基化形式和非糖基化形式PD-L1多聚泛素化。肿瘤细胞中USP22下调CSN5的多聚泛素化,稳定CSN5蛋白水平。已报道去泛素化酶CSN5能对PD-L1进行去泛素化修饰。本论文通过免疫共沉淀实验和免疫荧光实验证明,USP22与CSN5存在相互作用并且存在共定位。USP22不影响CSN5 mRNA水平,改变CSN5蛋白水平,调控CSN5蛋白的稳定性和蛋白酶体途径降解。野生型USP22而不是酶活性缺失的USP22降低CSN5的多聚泛素化,去除CSN5 K6、K11、K27、K29、K33、K63连接的泛素链,不影响K48连接的泛素链。肿瘤细胞中USP22与CSN5协同调控PD-L1蛋白水平。本论文实验表明,USP22促进PD-L1与CSN5的相互作用,同时CSN5促进PD-L1与USP22的相互作用。USP22和CSN5可能通过招募彼此,增强对PD-L1的调控作用。与单独敲低USP22或CSN5相比,同时敲低USP22与CSN5进一步下调了 PD-L1蛋白水平。肿瘤细胞中USP22通过调控PD-L1蛋白水平,进而影响PD-L1/PD-1信号通路,改变T细胞的活性,最终调控抗肿瘤免疫反应。流式细胞术实验表明,敲低USP22导致质膜PD-L1含量下降。C57BL/6小鼠皮下成瘤实验显示,敲低USP22显著抑制肿瘤生长,然而,在缺乏T细胞的裸鼠体内,敲低USP22几乎不影响肿瘤生长。USP22对肿瘤生长的影响依赖机体免疫系统T细胞的作用。免疫组化和免疫荧光实验揭示,敲低USP22下调肿瘤组织中CSN5和PD-L1蛋白水平,同时上调肿瘤浸润CD8+T细胞含量。T细胞杀伤实验表明,敲低USP22促进T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力,PD-L1过表达恢复T细胞的杀伤能力。TCGA数据库表明,USP22低表达与病人较好预后相关。为了探究USP22与PD-L1在病理学上的关系,本论文分析了不同肿瘤细胞系和病人样本中USP22与PD-L1表达情况。USP22与PD-L1蛋白水平在肿瘤细胞系和病人样本中具有正相关性,为USP22作为PD-L1的调控蛋白提供了病理学证据。结论（1）USP22与PD-L1存在相互作用,能够直接调控PD-L1的去泛素化,稳定PD-L1蛋白水平。（2）USP22与PD-L1已知的去泛素化酶CSN5存在相互作用,调控CSN5去泛素化,稳定CSN5蛋白,间接稳定PD-L1蛋白水平。（3）USP22敲低肿瘤组织中,PD-L1蛋白水平下调,同时CD8+T细胞增多,具有更高抗肿瘤免疫反应。（4）肿瘤细胞中USP22敲低促进浸润T细胞的杀伤能力,激活T细胞免疫反应。（5）USP22和PD-L1蛋白水平在肿瘤病人组织中呈正相关。研究意义本论文明确了 USP22是PD-L1新的调控蛋白,揭示了 USP22调控PD-L1的分子机制,探究了 USP22与CSN5的关系。在小鼠体内和小鼠肿瘤细胞系中,USP22对PD-L1的调控影响PD-L1介导的免疫抑制的功能。在病人肿瘤组织中,USP22与PD-L1的蛋白水平呈正相关性。综上所述,USP22可以作为肿瘤免疫治疗的潜在靶标,USP22抑制剂或许能够提高PD-L1/PD-1免疫检查点阻断治疗的效果。