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研究背景:肺癌是当今世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,肺癌分为小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（none-small cell lung cancer,NSCLC）,其中非小细胞肺癌（NSCLC）占比最高,约为85%,其病理类型以腺癌和鳞癌为主。在全世界范围内,肺癌在男性中的的发病率和死亡率均位居第一位,而在女性中肺癌的发病率仅次于乳腺癌,但死亡率仍位居首位。而根据中国国家肿瘤注册中心2015年统计的一份报告显示,由于人均寿命不断延长,老龄人口数量不断增加,肺癌的发病率和死亡率呈现持续上升趋势,中国人的肺癌总新发病例数和死亡病例数分别为73万人和60万人。目前已经成为我国发病率和死亡率均位居第一位的恶性肿瘤。由于肺癌症状隐匿,大多数肺癌患者确诊时已经是中晚期,预后不良,五年生存率为13%-17%。目前针对肺癌的治疗除了传统的手术治疗、放化疗外,尽管许多新兴的治疗手段,如靶向治疗以及免疫治疗也以开始应用于临床。但是由于肺癌与其他肿瘤一样,具有复发和转移的特点,肺癌患者的预后仍不理想,非小细胞肺癌患者的5年生存率只有15%-20%。在过去的十年中,随着分子测序技术的发展,在肺腺癌中鉴定出了表皮生长因子受体基因突变和棘皮动物微管相关类蛋白4-间变淋巴瘤激酶融合基因等肺癌驱动基因的突变,并开展了针对这些特定驱动基因的分子靶向治疗。与标准的化学疗法相比,新的分子靶向治疗可以显著改善肺癌患者的无进展生存期并具有相对较低的毒副作用。分子靶向治疗改变了某些肺癌亚组患者的临床结局,其5年生存率提高了 5%,但仍低于20%。针对这一状况,关于肺癌发生发展的具体分子机制及其治疗过程中的新的治疗靶点的问题苛待解决。研究出更多的能够用于肺癌患者诊断和治疗的分子机制对于肺癌患者的诊断和治疗具有重要价值。在精准医疗时代,这些关于肺癌分子生物学的研究可以用于更加精确地筛查肺癌患者并推动肺癌患者个体化治疗的发展。在NSCLC的疾病进展过程中,某些原癌基因过度表达,而另一些基因的表达则受到抑制。例如,在NSCLC发生发展的过程中,钙网蛋白（calnexin,CANX）的表达水平显著上调,并有研究者认为血清CANX水平检测可以用于临床作为检测早期肺癌的分子标志物。此外,细胞粘附分子（intercellular adhesion molecule,ICAM）等与非小细胞肺癌的诊断和预后相关的分子标志物也可用作分子靶向治疗的潜在新靶标。RNA结合蛋白是与单链或者双链RNA结合并且可以调控转录本表达的蛋白质。目前,已经有数千种RNA结合蛋白被发现,其在各种生物体内广泛表达。然而,它们的具体生物学功能和机制仍不清楚。CELF5是CELF/Bruno样蛋白家族成员,它是一种广泛存在于哺乳动物细胞的中的RNA结合蛋白。CELF5可以通过选择性剪切、转录抑制、转录激活以及去乙酰化等方式调控mRNA的表达。CELF5蛋白主要分布在细胞质中,其由3个保守的RNA识别序列组成,分别为RRM1、RRM2和RRM3,其中RRM2位于蛋白N端,RRM3在蛋白C端。CELFs可以参与调控靶mRNA的编辑、剪接和翻译过程。既往研究发现,CELF蛋白家族成员可以通过活化下游相关信号通路或者调控下游靶基因的表达,进而参与恶性肿瘤的发生发展过程。例如,WangHuaiming等人的研究发现,在结直肠癌中,CELF1可以结合并调控ETS2的表达促进细胞的侵袭和化疗耐药过程。Yiu To Yeung等人的研究发现,CELF2可以通过抑制PREX2/PTEN轴抑制非小细胞肺癌的生长。一项卵巢癌的研究发现,CELF2可以通过稳定FAM198B抑制卵巢癌的进展。另有一项研究发现,CELF2可以通过活化PI3K/Akt信号通路促进肝癌的发生。研究还发现,在结直肠癌中,CELF6作为一种潜在的肿瘤抑制因子,通过上调p21的表达进而抑制细胞的增殖。在人体内,CELF5的表达主要分布在前脑、中脑和后脑,在肼胝体和脑桥中表达较低。既往关于CELF5的研究主要集中在中枢神经系统,研究发现CELF5的异常表达与中枢神经系统疾病的发生有着密切的关系。而近年来的研究发现,CELF5可以通过与人巨细胞病毒相互作用并调控其基因组DNA的合成,从而参与恶性肿瘤的调控,提示CELF5可能与恶性肿瘤的发生有着密切的关系。而关于CELF5在人肺癌中的功能和机制,目前未见报道。Toll 样受体（Toll-like receptor,TLRs）是一种模式识别受体（pattern recognition receptor,PRRs）,这是由NussleinVolhard等人在1980年首次提出。TLRs可以用于检测入侵病原体上的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）,它可以识别多种PAMPs,如细菌的脂多糖、细菌鞭毛蛋白和病毒核酸等。TLR3是Toll样受体家族成员,它是一种核酸敏感受体。在各种类型的Toll样受体中,TLR3在病毒介导的固有免疫应答调节中起着重要作用,它可以识别病毒复制产物（dsDNA）以及合成配体聚肌苷多胞苷酸。TLR3广泛表达于多种细胞并且在细胞内与多种信号通路的活化有关。TLR3参与多种疾病的发生发展,近年来研究还发现,TLR3在恶性肿瘤的发生过程中发挥重要作用。在一项关于前列腺癌的研究中发现,川皮苷可以通过调控TLR3/IRF3信号通路参与前列腺癌的发生。一项关于乳腺癌的研究中发现,TLR3在乳腺癌发生过程中发挥抑癌基因作用。Songhuijuan等人的研究发现,TLR3的激动剂可以通过调节体内树突状细胞对黑色素瘤发挥治疗作用。BeatriceVanbervliet-Defrance等人的研究发现,在恶性间皮细胞瘤中,顺铂可以通过下调c-FLIP释放TLR3进而促进细胞凋亡。TLR3还可以做为早期非小细胞肺癌高危患者筛查的重要标志物。此外有研究还发现,人乳头瘤状病毒16型可以通过TLR3信号通路促进非小细胞肺癌细胞的增殖和迁移。上述研究结果表明,TLR3与肿瘤的发生有着密切的关联。研究目的:本课题组致力于研究肺癌发生发展过程中新的分子机制,即CELF5在肺癌发生发展中的作用及其具体分子机制,这有助于为将来肺癌的治疗提供新的药物靶点。材料和方法:1.在第一部分实验中,本课题组首先采用qRT-PCR方法,检测CELF5在人肺癌细胞系NCL-H1229、A549、H1975中的表达水平。在接下来的体外细胞实验中,我们通过RNA转染技术,构建了 sh-Ctrl和sh-CELF5稳转的肺癌细胞系（A549和H1975）。随后,我们通过BrdU实验、细胞流式技术、CCK-8实验以及克隆形成实验,在体外探究敲低CELF5后对肺癌细胞表型的影响。而在体内实验研究中,我们将选取的BALB/c雌性裸鼠分成两组,两组小鼠分别皮下注射sh-Ctrl和sh-CELF5肺癌细胞株（A549）,并培养35天,培养7-35天期间,每隔7天测量瘤体大小,并绘制肿瘤生长曲线。2.随后,在第二部分实验中,我们为了寻找CELF5的下游靶点,我们通过catRAPID omics软件预测了 CELF5可能结合的RNA,并且筛选出匹配程度最高的10个基因,并通过RNA-pul ldown实验检测CELF5是否能够直接与上述基因结合。我们通过采用RNA-pulldown-qRT-PCR技术检测肺癌细胞中CELF5可以富集到的mRNA,确认CELF5的潜在的下游靶点TLR3。3.在第三部分的研究中,我们通过qRT-PCR方法验证CELF5敲低后对上述基因在肺癌细胞系中表达的影响,并通过Wetsernblot方法检测上述基因在蛋白水平的变化情况。最后,我们分别构建了 CELF5单敲以及CELF5和TLR3双敲的肺癌细胞系,并通过流式细胞技术、CCK-8实验以及克隆形成实验,在体外探究CELF5单敲以及CELF5和TLR3双敲对肺癌细胞表型的影响。体内动物实验研究中,我们将选取的BALB/c雌性裸鼠分成三组,三组小鼠分别皮下注射sh-Ctrl、sh-CELF5以及sh-CELF5+sh-TLR3肺癌细胞株（A549）,并培养35天,培养7-35天期间,每隔7天测量瘤体大小,并绘制肿瘤生长曲线。实验结果:1.在第一部分实验中,本课题组研究发现,CELF5在不同肺癌细胞系中具有高丰度表达。CELF5低表达可以抑制肺癌细胞的增殖、生长以及克隆形成能力,而促进肺癌细胞的凋亡。皮下注射sh-CELF5细胞株（A549）的小鼠异体移植瘤形成能力显著减弱。2.在第二部分的研究中,我们发现TLR3、MTCYBP42、OR7E117P、GTF2IRD2P1和PNP可以有效结合在CELF5蛋白上。敲低CELF5后肺癌细胞中TLR3、HERC2P5、OR7E117P以及HSD17B12的mRNA表达水平显著升高。敲低CELF5后TLR3基因在蛋白水平的表达量显著增加。上述实验结果提示TLR3是CELF5的下游靶基因,而且CELF5可以抑制TLR3的表达。3.第三部分实验中,我们发现敲低CELF5后TLR3基因在蛋白水平的表达量显著增加。敲低CELF5可以抑制肺癌细胞的增殖和克隆形成能力,但是这些效应可以被共转染sh-TLR3所逆转。皮下注射sh-CELF5细胞株（A549）的小鼠异体移植瘤形成能力显著减弱,但是皮下注射sh-CELF5+sh-TLR3细胞株（A549）后,可以增强小鼠异体移植瘤形成能力。实验结论:综上所述,CELF5在非小细胞肺癌细胞系中呈现高表达,它在肺癌的发生发展过程中发挥促癌基因作用;TLR3基因是CELF5下游结合靶基因,并且CELF5可以抑制TLR3的表达;TLR3可以抑制CELF5在肺癌发生过程中所发挥的促癌作用。因此推断出,CELF5可能是肺癌发生的重要驱动基因,抑制CELF5的表达可能是将来治疗肺癌的新策略,CELF5有望成为将来肺癌精准治疗的一个重要药物靶点。