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研究背景和目的牙周炎、风湿性关节炎等慢性炎症、肿瘤及外伤等多种疾病均可导致骨破坏及缺损,其中慢性炎症是导致骨质破坏的最为常见的一类疾病。致病菌导致的炎症的刺激影响牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）的成骨能力,导致修复再生功能异常。人PDLSCs因其取材简单容易获易得且具有强大的自我更新及多向分化潜能,已成为骨缺损修复和再生的种子细胞之一。临床常见的致病菌所致牙周的慢性炎症微环境,抑制PDLSCs的成骨分化能力,骨破坏后内在再生能力有限仍然是一个重要的医学问题。一氧化碳释放分子（carbon monoxide releasing molecules,CORMs）携带并且可控的释放一氧化碳（carbon monoxide,CO）,是一种具有心脏保护、增强血管活性、抗炎、抗凋亡等多种作用的羰基化合物。CORM-3（carbon monoxide releasing molecule-3）第三代产品,溶于液体即可分解出CO,与其它代相比,毒性更低,使用条件更加完善和简单。本课题组发现CORMs能抑制大鼠实验性牙周炎,改善牙周指标。但是CORMs对PDLSCs的成骨的影响尚未见到公开的报道。前期,我们课题组发现CORM-3刺激人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）可导致细胞血红素氧合酶-1（heme oxygenase,HO-1）的高表达。另外,高表达的HO-1能够促进间充质干细胞的成骨分化,由此我们推测或许CORMs能够对hPDLSCs的成骨分化有促进作用。随着相关的CORMs的生理效能方面的研究,关于CORM的作用机制的研究也逐步涉及到了微小核糖核酸（microRNA,miRNA）。miRNAs是一类没有编码功能的小核糖核酸,组成约有19～24个核苷酸,能识别相应的靶基因并与其结合且行负向调控。miRNAs在调节干细胞增殖和分化过程中起着重要作用,miRNAs多以信号转导通路上的基因作为靶基因,由此,它们可以在转录后水平上精确地调节信号通路。因此,本研究通过hPDLSCs体外实验,研究CORM-3对hPDLSCs成骨分化的影响,通过裸鼠颅骨缺损体内实验,研究CORM-3全身应用对颅骨缺损区的植入的hPDLSCs成骨分化的影响,并对CORM-3诱导hPDLSCs成骨分化24h中的miRNAs进行高通量测序。结果表明:CORM-3可引起hPDLSCs中miRNAs的差异表达,导致部分miRNAs的表达上调或下调。并据此进一步研究CORM-3诱导hPDLSCs成骨分化在miRNA水平上的机制。材料和方法1.hPDLSCs的分离培养和生物学特性鉴定取11-18岁离体的年轻恒牙,组织块法分离并培养原代人牙周膜细胞,行细胞来源鉴定。P0代细胞,通过有限稀释法分离培养hPDLSCs,通过流式细胞仪检测表面标记;检测克隆形成能力;成脂向、成骨向诱导分化,并使用油红O染色、茜素红染色鉴定分化能力。2.CORM-3对hPDLSCs细胞活性的影响hPDLSCs分别在0（对照组）、100、200、400和800 μM的浓度的CORM-3培养基进行培养,孵育24 h后,在每个孔中加入10 μL CCK8试剂,并根据说明书重复三次检测不同浓度CORM-3对hPDLSCs细胞活性的影响3.CORM-3对hPDLSCs成骨分化的影响选取400μM为CORM-3工作浓度,检测CORM-3对hPDLSCs成骨的影响。hPDLSCs分为4组,成骨组,用成骨诱导基培养细胞;CORM-3+成骨组,用含400 μM的CORM-3的培养液预处理细胞24 h,随后用成骨诱导培养液完全更换。失活CORM-3+成骨组,用含400 μM失活CORM-3的培养液预处理细胞24 h,然后用成骨诱导培养基完全更换;对照组,α-MEM培养液（含10%血清）。所有组的培养液每3天更新一次。在第3、7、14天检测各组成骨相关标志物 Runx2、ALP、OPN（编码基因 SPP1,NM000582.3）的 mRNA 和蛋白表达,以及7天的ALP活性,并进行统计分析。在14、21天行茜素红染色,拍照留存。并配制氯代十六烷基吡啶（CPC）溶液进行钙定量检测,检测各组OD值,分析。4.CORM-对裸鼠颅骨缺损的作用裸鼠随机分为4组,CORM-3+hPDLSC组:骨缺损区铺设负载有hPDLSCs的胶原膜,CORM-3溶液全身应用;生理盐水+hPDLSC组:骨缺损区铺设负载hPDLSCs的胶原膜,生理盐水腹腔注射;CORM-3组:骨缺损区铺设胶原膜,CORM-3溶液全身应用;生理盐水组（对照组）:骨缺损区铺设胶原膜,生理盐水腹腔注射。于裸鼠颅骨双侧区域分别创建一个外径为4 mm的全厚颅骨极限缺损模型,术后4周取材行HE、Masson染色及术后7周microCT扫描,观察各组新骨形成情况,使用Image J、GraphPad Prism.6分析,软件（CT Analyser;Bruker）用来分析微观结构参数。5.CORM-3作用hPDLSCs成骨诱导后的miRNAs表达、qRT-PCR验证差异miRNAs及hsa-miR-195-5p的筛选与确定分别提取“CORM-3+成骨诱导24 h组”及“成骨诱导24 h组”细胞,交与诺禾致源中国公司（中国）行miRNA高通量测序。选取表达差异较大的microRNAs通过qRT-PCR验证测序结果,通过相关数据库挑选和文献分析选择hsa-miR-195-5p进行后续实验研究。6.Hsa-miR-195-5p在CORM-3作用hPDLSCs成骨分化中的作用通过细胞转染技术过表达和抑制hsa-miR-195-5p,茜素红染色、qRT-PCR和Western blot（WB）技术检测成骨相关指标。实验分为7组。成骨组:hPDLSCs于成骨诱导液中培养;CORM-3+成骨组:hPDLSCs 在含 CORM-3 的成骨诱导液孵育;mimics 组:hsa-miRNA-195-5p mimics转染hPDLSCs 1 day后,更换为含CORM-3的成骨诱导液培养;mimics NC 组:hsa-miR-195-5p mimics NC 转染 hPDLSCs 1 day 后,换为含 CORM-3 的成骨诱导液培养;对照组:hPDLSCs于α-MEM培养液（10%FBS）;inhibitor组:hsa-miR-195-5p inhibitor 转染 hPDLSCs 24 h 后,换液为含 400 μM CORM-3的成骨诱导液培养;inhibitor NC 组:hsa-miR-195-5p inhibitor NC 转染hPDLSCs 24 h后,换液为含400 μM CORM-3的成骨诱导液培养,通过qRT-PCR法及Western blot（WB）法检测每组的细胞3天、7天Runx2、ALP的mRNA和蛋白的表达水平的变化;14天时检测矿化情况,并分析。7.Hsa-miR-195-5p靶基因预测和验证根据靶基因预测数据库Targetscan 5.0及miRanda等,结合生物信息学分析预测hsa-miR-195-5p作用的靶基因,选择与成骨相关的的靶基因BMPR1A进行后续研究;通过过表达或者抑制细胞hsa-miR-195-5p,检测细胞内BMPR1A蛋白的表达水平,灰度值分析:Image J软件;双荧光素酶报告实验验证靶基因BMPR1A。8.BMPR1A在CORM-3作用hPDLSCs成骨中的作用QRT-PCR法及WB法检测CORM-3作用的hPDLSCs成骨分化中BMPR1A mRNA及蛋白表达情况,并分析。通过细胞转染技术过表达或者抑制细胞内BMPR1A,分为BMPR1A过表达和沉默两部分。细胞分为6组:CORM-3+成骨组:含CORM-3（400μM）的成骨诱导液培养细胞;过表达组:BMPR1A过表达载体转染细胞24 h后,更换为含400μM CORM-3的成骨诱导液培养;BMPR1ANC组:BMPR1ANC转染细胞24 h后,更换为含400μM CORM-3的成骨诱导液培养;对照组:含10%FBS的α-MEM培养液培养。沉默组:BMPR1A siRNA转染细胞24 h后,更换为含400 μM CORM-3含400μM的成骨诱导液培养;siRNA NC组:BMPR1A siRNA NC转染细胞24 h后,换为含CORM-3（400 μM）的成骨诱导液培养;3、7天时通过qRT-PCR法、WB法分别检测各组ALP、Runx2的mRNA与蛋白表达,并行统计学分析。9.过表达靶基因BMPR1A的挽救实验通过细胞转染技术共同转染hsa-miR-195-5p mimics与BMPR1A过表达载体,3、7天时qRT-PCR、WB法分别检测各组Runx2、ALP的mRNA与蛋白的表达水平,并分析。14天时茜素红染色,并分析。研究结果:1.hPDLSCs的分离培养和生物学特性鉴定hPDLSCs通过细胞形态和特殊的细胞表面抗原进行鉴定。hPDLSCs表现出典型的纺锤形成纤维细胞的形态。成骨诱导和成脂诱导3 W左右,通过形成钙盐沉积和脂肪滴来确认hPDLSCs的成骨和成脂分化能力。单克隆图片显示细胞团簇由单个hPDLSC生长获得。流式细胞分析显示,培养的hPDLSCs的造血干细胞表面标志物CD45（0.16%）和CD34（1.39%）呈低表达,而间充质干细胞表面标志物 CD44（99.9%）、CD90（99.9%）和 CD105（99.7%）成高度正表达,符合hPDLSCs的表型特征。2.CORM-3对hPDLSCs细胞活性的影响CCK-8检测结果显示100、200和400 μM的CORM-3处理促进了hPDLSCs的增殖,然而,400 μM的CORM-3比200 μM的CORM-3显示了更显著的促进作用（P＜0.05）。与对照组相比,800 μM CORM-3处理对hPDLSCs具有明显毒性（P＜0.05）。基于这些数据,400 μM CORM-3被用于后续实验。3.CORM-3对hPDLSCs成骨分化的影响在CORM-3+成骨组中,在第3、7和14天,OPN（编码基因SPP1,NM000582.3）、Runx2和ALP的mRNA和蛋白水平高于其他组（P＜0.001）。与成骨组相比,失活CORM-3+成骨组的细胞显示Runx2、ALP和OPN（编码基因SSP1）的mRNA和蛋白表达没有明显差异。在第3、7和14天,CORM-3+成骨组的ALP活性明显高于其他组（P＜0.001）。另外,在每个时间点上,失活CORM-3+成骨组和成骨组的细胞ALP活性没有明显差异。在第14天和第21天,CORM-3+成骨组的矿化程度明显高于其他三个组（P＜0.001）。与对照组相比,成骨组的钙盐沉积明显增加（P＜0.05）。失活CORM-3+成骨组的矿化程度与成骨组无明显差异。以上数据均有统计学意义。4.CORM-3对裸鼠颅骨缺损修复的影响HE染色和Masson染色结果显示:CORM-3+hPDLSC组在缺损区发现大片新骨,新骨面积比明显高于其他组（P＜0.05）。CORM-3组和正常盐水+hPDLSC组新形成的骨的百分比明显高于对照组（P＜0.05）。对照组只有一些细胞散落在骨缺损区。Micro-CT分析显示,在CORM-3+hPDLSC组的动物颅骨缺损区域有较大的高密度区域,CORM-3+hPDLSC组的骨量分数（BV/TV）明显高于其他三组。CORM-3+hPDLSC组的骨小梁数量（Tb.N）和Tb.Th均为四组中最高（P＜0.001,P＜0.05）,而Tb.Sp则明显低于其他三组（P＜0.05）。CORM-3组和生理盐水+hPDLSC组之间的Tb.N、Tb.Th及Tb.Sp没有明显的统计学差异。5.CORM-3作用hPDLSCs成骨诱导后的miRNAs表达、qRT-PCR验证差异miRNAs及hsa-miR-195-5p的筛选与确定（1）聚类分析和火山图分析miRNA芯片结果,以P＜0.05为设定,有8个miRNA升高,2个miRNA降低,10个miRNAs的变化有统计学差异。（2）选取 hsa-miRNA（132-3p、212-3p、195-5p、199b-5p）通过 qRT-PCR验证测序结果。结果:（1）表达升高的 miRNAs:hsa-miRNA-132-3p、hsa-miRNA-212-3p;表达下降的 miRNAs:hsa-miRNA-195-5p、hsa-miRNA-199b-5p。（3）qRT-PCR验证测序结果:hPDLSCs在CORM-3（400 μM）溶液里培养24 h后,更换成骨诱导液24 h,比单独成骨诱导液中培养24 h后,hsa-miRNA-212-3p表达升高,hsa-miRNA-195-5p/199b-5p表达降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。has-miRNA-132-3p的表达与对照组相比,无统计学意义,与测序结果不相符。选取hsa-miR-195-5p进一步研究。6.Hsa-miR-195-5p 在 CORM-3 作用 hPDLSCs 成骨中的作用过表达hsa-miRNA-195-5p后,通过qRT-PCR及WB检测成骨相关因子的mRNA和蛋白（ALP、Runx2）表达降低,茜素红染色减弱;相反,抑制hsa-miRNA-195-5p后,hPDLSCs的成骨向分化能力增强。7.Hsa-miR-195-5p 靶基因验证（1）生物信息数据库分析结合双荧光素酶报告基因检测,证实BMPR1A是 hsa-miRNA-195-5p 的靶基因。（2）通过细胞转染hsa-miR-195-5p mimics 48 h后,WB检测细胞内BMPR1A表达明显减少,相反,抑制hsa-miR-195-5p 48 h后,BMPR1A表达明显增加。（P＜0.05）8.BMPR1A在CORM-3作用hPDLSCs成骨中的作用CORM-3作用hPDLSCs促成骨分化过程中,BMPR1A蛋白表达水平显著升高。通过细胞转染技术使BMPR1A升高后,3天和7天时Runx2、ALP的mRNA与蛋白表达水平以及14天时的矿化能力均显著增强（P＜0.05）;而抑制BMPR1A表达后,Runx2、ALP的mRNA与蛋白表达水平以及14天时的矿化能力均显著减弱（P＜0.05）。9.过表达靶基因BMPR1A的挽救实验hsa-miR-195-5p mimics分别与过表达BMPR1A载体和空载体共转染,3天、7天后hsa-miR-195-5p mimics与BMPR1A过表达共转染组的细胞内Runx2、ALP的mRNA与蛋白表达水平比mimics+vector（空载体）转染组明显回升,与CORM-3+成骨组持平或接近;14天后共转染组的矿盐沉积接近CORM-3+成骨组,半定量分析显示没有统计学差异（P＞0.05）,共转染组比mimics+vector（空载体）转染组的矿化明显增强。研究结论1.CORM-3经由其释放的CO介导hPDLSCs成骨分化。2.CORM-3的全身应用联合hPDLSCs缺损区移植促进了裸鼠颅骨极限缺损的修复。3.CORM-3作用hPDLSCs在成骨诱导后有8个miRNAs表达上调,2个miRANs表达下调。4.Hsa-miR-195-5p靶向BMPR1A调控CORM-3促进hPDLSCs成骨分化。其中hsa-miR-195-5p表达下降,具有负调控作用;BMPR1A增加,具有正调控作用。转染BMPR1A过表达载体能够挽救hsa-miR-195-5p mimics带来的成骨减弱。创新及意义本课题以hPDLSCs作为体外实验模型,通过对CORM-3刺激细胞后相关成骨因子的研究,显示CORM-3通过释放的CO促进hPDLSCs成骨分化。以裸鼠颅骨缺损为体内实验模型,通过给予裸鼠腹腔注射CORM-3促进缺损区hPDLSCs新骨形成量增加的研究,我们报道CORM-3诱导hPDLSCs促进裸鼠颅骨缺损的修复,为骨缺损的治疗提供了实验基础和新的方向。通过对CORM-3作用hPDLSCs成骨诱导的细胞行miRNA高通量测序,确定了差异表达基因,并经生物信息学分析及实验,确定并验证了靶基因,报道了 CORM-3通过hsa-miR-195-5p/BMPR1A通路促进hPDLSCs成骨分化,为骨缺损的治疗提供了理论基础和方向。