论文部分内容阅读
骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种复杂的关节退行性疾病,是导致关节功能障碍的主要原因,主要特征是关节软骨的逐渐破坏,关节软骨损伤可归因于多种因素,包括异常的基因表达、氧化应激、异常的软骨细胞凋亡、炎症反应和软骨基质降解等。OA是一种异质性和多层面疾病,具有多种分子和临床表型,目前OA的发病机制尚未完全阐明。因此,探索OA软骨细胞损伤进展中的关键分子和指标,对了解OA的发病机制和防治具有重要意义。环状RNA（circRNAs）是一类新型非编码RNA,研究表明circRNA在OA中表达异常,可以通过调节软骨基质降解、炎症反应和软骨细胞凋亡,进而影响OA进展,可作为OA新的诊断标记物及治疗靶点。circRNA表达谱提供了大量circRNA,与正常组织相比,它们在OA组织中有不同的表达。在这些circRNA中,circ0001103的表达下调,提示circ0001103可能参与OA病理机制的调控。但circ0001103在OA中的作用机制尚未完全清楚,因此本研究拟探讨circ0001103在OA发生发展过程中的功能以及调控机制。既往研究表明,circRNA可以作为“海绵分子”吸附MicroRNAs（miRNAs）,降低miRNAs表达,从而调控多种病理生理过程。miRNAs是一类在人体疾病中具有广泛调控作用的小分子RNA。研究表明,MiR-375可能是重要的炎症介质,因为MiR-375在多种炎症性疾病中发挥着重要的作用,比如炎症性肠病、脂肪肝病、心肌梗死等。然而,miR-375对OA发展中的作用机制尚无相关研究。Sirtuin 1（SIRT1）属于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖的去乙酰化酶的Sirtuin家族。据报道,SIRT1可与NF-κB、p53等转录因子相互作用,参与软骨形成和分化。目前SIRT1在OA中的作用机制尚不清楚,需要进一步阐明。因此,本研究拟探讨circ0001103是否可通过靶向调控miR-375/SIRT1的表达从而参与OA的发病机制,为阐明OA的发病机制提供新的思路。本研究主要分为三部分内容:第一部分为circ0001103与OA患者炎症反应及软骨代谢的相关性分析;第二部分为circ0001103在OA细胞模型中的功能研究;第三部分为circ0001103通过靶向调控miR-375/SIRTl抑制OA进程。第一部分circ0001103与OA患者炎症反应及软骨代谢的相关性分析目的:探讨circ0001103在OA患者关节软骨组织中的表达及其与炎症反应和软骨代谢相关指标的相关性。方法:（1）选取本院30例OA患者的关节软骨组织作为实验组,10例正常关节软骨组织作为对照组,采用qRT-PCR法与Western blot法分别检测正常关节软骨组织和OA关节软骨组织中的炎性因子(IL-8、IL-6、TNF-α和基质降解相关因子（Ⅱ型胶原的编码基因COL2A1、基质降解酶ADAMTS4）的基因和蛋白表达量;（2）用qRT-PCR法检测正常关节软骨组织、OA关节软骨组织中的circ0001103的表达量;用Pearson法分析OA患者关节软骨组织中circ0001103与 IL-8、IL-6、TNF-α、COL2A1、ADAMTS4 表达量的相关性。结果:（1）OA关节软骨组织中的炎性因子包括IL-8、IL-6、TNF-α表达升高,降解酶ADAMTS4的表达量升高（P＜0.05）,而Ⅱ型胶原的编码基因COL2A1表达量降低;（2）OA关节软骨组织中circ0001103的表达量低于正常软骨组织（P＜0.05）;（3）circ0001103与炎性因子及基质降解酶的表达呈负相关,而与Ⅱ型胶原的编码基因呈正相关:circ0001103与IL-8负相关（r=-0.5743,P=0.009）;circ0001103 与 IL-6 呈负相关（r=-0.5414,P=0.0020）;circ0001103 与 TNF-α呈负相关（r=-0.6014,P=0.0004）;circ0001103 与 ADAMTS4 呈负相关（r=-0.5709,P=0.0010）;circ0001103 与 COL2A1 呈正相关（r=0.5018,P=0.0047）。结论:circ0001103在OA关节软骨组织中表达下调,并且与OA软骨组织的炎症反应及软骨基质代谢密切相关。第二部分circ0001103在OA细胞模型中的功能研究目的:探讨circ0001103对IL-1β诱导的OA细胞模型中软骨细胞增殖、凋亡、炎症反应及软骨基质代谢的影响。方法:（1）构建OA细胞模型:用含有10 ng/mLIL-1β的培养基处理原代软骨细胞24h,记为IL-1β组（实验组）;将用普通培养基培养的的软骨细胞记为对照组;（2）构建过表达 circ0001103 的细胞模型:将 pCD5-ciR、circ0001103 过表达载体分别转染至软骨细胞后加入含有10 ng/mL IL-1β的培养基处理软骨细胞 24h,分别记为对照组（IL-1β+pCD5-ciR 组）、过表达组（IL-1β+circ0001 103组）;（3）采用qRT-PCR法检测IL-1β诱导的软骨细胞中circ0001103的表达量;采用MTT法检测软骨细胞活力;采用EdU实验检测细胞增殖能力;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;采用qRT-PCR法与Western blot法分别检测IL-8、IL-6、TNF-α、COL2A1、ADAMTS4、促凋亡基因BAX、抑凋亡基因BCL2的基因和蛋白表达量。结果:（1）IL-1β诱导的软骨细胞中circ0001103呈低表达（P＜0.05）;（2）与对照组相比,IL-1β处理后软骨细胞活力、增殖能力和Ⅱ型胶原的编码基因COL2A1（P＜0.05）降低,炎性因子IL-8、IL-6、TNF-α、基质降解酶ADAMTS4表达量升高（P＜0.05）,细胞凋亡率升高（P＜0.05）,促凋亡基因BAX表达增加而抑凋亡基因BCL2的表达量降低（P＜0.05）;（3）与对照组（IL-1β+pCD5-ciR）组比较,circ0001103 过表达组（IL-1β+circ0001103组）的软骨细胞活力、增殖能力、Ⅱ型胶原的编码基因COL2A1表达增加（P＜0.05）,炎性因子IL-8、IL-6、TNF-α、以及基质降解酶ADAMTS4的表达量降低（P＜0.05）,细胞凋亡率降低（P＜0.05）,促凋亡基因BAX表达降低而抑凋亡基因BCL2的表达量增加（P＜0.05）。结论:circ0001103过表达可增强IL-1β诱导的OA细胞模型中软骨细胞活力及促进细胞增殖,可以抑制细胞凋亡,细胞炎症反应及基质降解代谢。第三部分circ0001103通过靶向调控m i R-375/SIRT1抑制OA进程目的:探讨circ0001103对软骨细胞增殖、凋亡、炎症反应及基质降解代谢的影响,以及调控OA进程的机制。方法:（1）筛选circ0001103的下游靶点:通过双荧光素酶报告实验与RIP实验验证circ0001103与miR-375的靶向关系、miR-375与下游基因SIRT1的靶向关系;（2）采用qRT-PCR法与Western blot法分别检测正常关节软骨组织、OA关节软骨组织、IL-1β诱导的软骨细胞中miR-375、SIRT1的表达量;Pearson法分析OA患者关节软骨组织中miR-375与circ0001103表达量的相关性,以及miR-375与SIRT1表达量的相关性;（3）实验分组:将circ0001103和miR-con、circ0001103过表达载体和miR-375 mimics、in-miR-con、in-miR-375、in-miR-375 和 si-con、in-miR-375 和si-SIRT1分别转染至软骨细胞后加入含有浓度为10ng/mLIL-1β处理24h,分别记为 circ0001103+miR-con 组、circ0001103+miR-375 组、IL-1β+pCD5-ciR 组、IL-1β+circ0001103 组、IL-1β+circ0001103+miR-con 组、IL-1β+circ0001103+miR-375组;采用MTT法检测细胞活力;采用EdU实验检测细胞增殖能力;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;采用qRT-PCR法与Western blot法分别检测IL-8、IL-6、TNF-α、COL2A1、ADAMTS4、BAX、BCL2 的基因和蛋白表达量。结果:（1）circ0001103可靶向结合miR-375,miR-375可靶向结合SIRT1;与正常关节软骨组织比较,OA关节软骨组织中miR-375的表达量升高（P＜0.05）,SIRT1的表达量降低（P＜0.05）;（2）circ0001103 与 miR-375 的表达呈负相关（r=-0.4691,P=0.089）,miR-375与SIRT1的表达呈负相关（r=-0.522,P=0.0031）;IL-1β诱导的软骨细胞中miR-375 的表达量升高（P＜0.05）,SIRT1 的表达量降低（P＜0.05）;circ0001103可通过负向调控miR-375的表达而正向调控SIRT1的表达;（3）与对照组（IL-1β+circ0001103+miR-con 组）比较,过表达 miR-375（IL-1β+circ0001103+miR-375组）细胞活力降低（P＜0.05）,EdU 阳性细胞率降低（P＜0.05）,凋亡增加,BCL2表达降低而BAX表达增加,COL2A1、BCL2的表达量降低（P＜0.05）,IL-8、IL-6、TNF-α ADAMTS4的表达量升高（P＜0.05）,细胞凋亡率升高（P＜0.05）;而抑制 miR-375（IL-1β+in-miR-375 组）后,细胞活力及增殖能力增加（P＜0.05）,凋亡及炎症水平降低,COL2A1、BCL2的表达量升高（P＜0.05）,IL-8、IL-6、TNF-α、ADAMTS4、BAX的表达量降低（P＜0.05）;（4）与 IL-1β+in-miR-375+si-con 组比较,IL-1β+in-miR-375+si-SIRT1 组细胞活力降低（P＜0.05）,EdU 阳性细胞率降低（P＜0.05）,COL2A1、BCL2的表达量降低（P＜0.05）,IL-8、IL-6、TNF-α、ADAMTS4、BAX的表达量升高（P＜0.05）,细胞凋亡率升高（P＜0.05）。结论:circ0001103过表达可通过靶向抑制miR-375的表达而上调SIRT1的表达,从而增强IL-1β诱导的软骨细胞活力及促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、炎症反应、基质降解代谢,因此本研究认为circ0001103通过靶向调控miR-375/SIRT1抑制OA进程是可能的发病机制。