论文部分内容阅读
研究背景根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的全球最新癌症数据,在癌症分布类型上,2020年乳腺癌新增人数达226万,成为全球第一大癌症。尽管乳腺癌的治疗已取得了长足的发展,但是早期复发、远处转移和药物耐药仍然很常见,也是影响乳腺癌患者预后的主要因素,研究和发现乳腺癌进展的分子机制,寻找新的治疗靶标是十分重要的。在我们课题组近期的研究中,基于癌组织的转移组和非转移组做了一组病例的基因芯片研究（GSE72307）,显示驱动蛋白超家族（KIFs）成员26A（KIF26A）与非转移组胃癌相比,在转移组中表达是明显下调的。KIFs参与了许多生物和生理过程,包括微管依赖的分子马达、微管稳定剂和解聚剂,这些都是细胞形态发生和哺乳动物发育的基础。位于染色体14q32.33的KIF26A是Kinesin-11家族的成员,与其他KIFs不同,KIF26A有一个不典型的运动结构域,可以与微管结合,但不水解ATP。KIF26A在癌症中仅有少量的研究,有研究证实与WDR5-MLL1结合的HOTTIP（远端HOXA转录本,一种长链非编码RNA）复合物通过直接在其启动子处诱导H3K4me3可反式激活致癌蛋白KIF26A。有学者从大规模、间接的mRNA表达和RNAi数据发现KIF26A基因表达与结肠癌患者的生存率相关。新近的研究通过TCGA数据库的预测分析,KIF26A被预测在乳腺癌中低表达,但是没有经过样本验证。目前KIF26A在乳腺癌内的研究尚属空白,KIF26A在乳腺癌内的表达情况,在乳腺癌发挥怎样的生物学功能,并且其作用机制如何,都是未知领域,也是本课题要解决的主要问题。研究方法1、通过临床样本验证,了解KIF26A基因在乳腺癌中的表达及临床意义（1）收集乳腺癌患者新鲜样本46例,分为腋窝淋巴结有转移和无转移组,通过荧光实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）,检测KIF26A在乳腺癌组织中的相对mRNA的表达;（2）对199例乳腺癌患者石蜡包埋组织芯片进行免疫组织化学（IHC）检测,根据评分结果和随访情况,进行临床病理参数分析及生存分析。2、体外细胞水平功能学实验,了解KIF26A基因在乳腺癌内的生物学功能（1）通过RT-qPCR实验检测KIF26A基因在乳腺癌细胞株（MDA-MB-231,MCF-7,MDA-MB-468）中的本底表达;合成KIF26A的小干扰RNA和构建KIF26A的过表达载体,通过RT-qPCR进行转染效率测定;（2）沉默或过表达KIF26A基因后,通过MTS实验、EDU实验、克隆形成实验,检测KIF26A基因对乳腺癌细胞增殖功能的影响;（3）沉默或过表达KIF26A基因后,通过迁移、浸润实验及划痕实验,验证KIF26A基因对乳腺癌细胞迁移和浸润能力的影响;（4）沉默或过表达KIF26A基因后,通过流式细胞仪检测,验证KIF26A基因对乳腺癌细胞周期进展及凋亡的影响。3、KIF26A转录调控机制研究（1）通过软件NCBI和UCSC确定KIF26A基因距离转录起始位置（Tss）上游5’区2000bp序列,扩增并克隆KIF26A启动子区,并构建PGL3报告基因质粒,经Sanger测序验证质粒序列。通过双荧光素酶实验,得到启动子活性的结果,确定可能的启动子区;（2）输入启动子序列,利用软件JASPAR和ALGGEN预测可能的转录因子和结合序列。选择JASPAR软件评分较高的转录因子,扩增并克隆转录因子过表达载体,所有的过表达载体均经DNA测序验证;（3）对MCF-7和293T细胞系同时转染启动子-PGL3载体和转录因子过表达质粒,同时转染启动子-PGL3载体和空载体作为对照,通过双荧光素酶报告基因检测启动子活性的改变。对MDA-MB-468和MCF-7转染转录因子过表达载体,转染空载体作为对照,通过RT-qPCR的方法检测KIF26A mRNA相对表达水平。通过以上两个实验,可明确对KIF26A发挥转录作用的转录因子;（4）通过JASPAR软件预测转录因子与KIF26A启动子区的结合位点,分别突变其中的两个碱基并构建突变PGL3载体,且经Blast不会与其他基因混淆,经测序鉴定,双荧光素酶报告基因检测启动子活性的改变,从而明确核心启动子位置;（5）染色质免疫共沉淀实验（CHIP）进一步确定转录因子与KIF26A启动子区的直接结合作用;（6）沉默及过表达转录因子,通过RT-qPCR及Western Blot实验明确转录因子对KIF26A及下游通路相关基因的调控作用。4、KIF26A基因功能相关的下游通路研究（1）通过细胞转染SiRNA-KIF26A和Si-NC,送检全人类基因组微阵列芯片来分析这两组之间的差异表达基因,运用标准富集的方法进行GO和Pathway分析,寻找KIF26A的下游调节机制;（2）在乳腺癌细胞系沉默或过表达KIF26A基因后,分别收集总RNA和总蛋白,进行RT-qPCR和Western Blot检测下游通路相关基因的表达,确定下游通路。5、裸鼠成瘤动物实验通过体外沉默KIF26A慢病毒载体（LV-shKIF26A）构建KIF26A沉默MCF-7细胞株,上肢腋窝皮下注射MCF-7稳转细胞株,研究沉默KIF26A基因对乳腺癌细胞生长及局部浸润的影响,通过Western Blot检测,进一步在移植瘤组织中鉴定KIF26A参与调控的信号通路相关分子表达情况。6.统计学分析实验用三个复孔,所有的实验重复三遍,SPSS软件（Version 15.0）和GraphPad Prism 6用于统计学分析。双尾Fisher’s精确检验用于计算KIF26A表达与临床病理参数的关系,Kaplan-Meier法和Log-rank检验用于计算生存曲线,双尾的t-检验用于其他数据的检验,P＜0.05被认定为有统计学意义。研究结果1、KIF26A高表达与乳腺癌ER阳性、低组织学级别和腋窝淋巴结转移相关（1）检测46例乳腺癌新鲜样本中KIF26A和KIF26B的相对mRNA表达水平,结果提示,KIF26A在腋窝淋巴结转移组里明显升高,而KIF26B在两组之间无明显差异;（2）免疫组织化学检测石蜡包埋的199例乳腺癌组织芯片样本,通过ROC曲线,确定KIF26A表达强度与阳性细胞百分数相乘的分数为85%时,可以很好的区分组织学低级别和高级别的乳腺癌,曲线下面积（AUC）为0.621。临床病理参数分析证实KIF26A高表达与乳腺癌ER阳性、低组织学级别和腋窝淋巴结转移相关,而与年龄、病理学分期、5年DFS、OS无显著相关。2、KIF26A促进乳腺癌细胞增殖、细胞周期进展、迁移、浸润,抑制细胞凋亡（1）检测KIF26A在乳腺癌细胞系中的表达,提示在低侵袭性的、Luminal表型的MCF-7细胞株内表达量最高;（2）MTS、EDU实验及克隆形成实验结果均提示KIF26A促进乳腺癌细胞增殖;（3）通过流式细胞仪进行细胞周期及凋亡检测,提示KIF26A基因促进乳腺癌G1/S期细胞周期进展,抑制细胞凋亡;（4）迁移、浸润实验及划痕实验证实KIF26A促进乳腺癌细胞迁移、浸润。3、KIF26A的核心启动子区位于相对于TSS-395/-385区域内,E2F1通过与KIF26A启动子区直接结合,发挥正向转录调节作用（1）成功构建了 KIF26A转录起始位点（Tss）上游的2000bp全长及截短序列的PGL3载体,命名为P1-P10,并通过在MCF-7和293T细胞内转染P1-P10 PGL3载体,经双荧光素酶实验验证,确定P6-P7位置,即-415和-360之间序列的缺失显著降低了荧光素酶活性,表明跨越这55bp核苷酸的启动子区是KIF26A基因基础转录活性区域;（2）通过两个软件分别预测了51个和13个转录因子,其中E2F1和SP1为两个软件均有的转录因子;（3）成功扩增并克隆了转录因子CREB,SP1,EGR1,KLF5,ELK1,TFAP2A,GCF4,C/EBP alpha和SP3 PcDNA3.1过表达载体,及E2F1 P-ENTER过表达载体。双荧光素酶实验证实转染E2F1过表达载体可显著提高KIF26A启动子活性,RT-qPCR实验证实转染E2F1过表达载体可显著提高KIF26AmRNA相对表达水平,提示E2F1对KIF26A的正向转录调节作用;（4）用突变载体T1、T2或T3联合P6-PGL3质粒和TK质粒转染293T和MCF-7细胞,携带T1的荧光素酶报告基因的活性比携带T2或T3的基因受到更明显的抑制（P值＜0.01）。因此,我们确定预测的E2F1结合位点1（-395/-385）是KIF26A的核心启动子区;（5）通过CHIP实验,经琼脂糖凝胶电泳分离的PCR产物和RT-qPCR分析表明,KIF26A启动子区域的DNA序列与E2F1抗体洗脱的沉淀蛋白结合,而不与非特异性IgG（阴性对照抗体）结合,表明KIF26A的最小启动子位于相对于TSS-395/-385区域内,直接与转录因子E2F1结合。4、KIF26A通过CDK-RB-E2Fs通路促进乳腺癌细胞增殖和细胞周期进展（1）通过全人类基因组微阵列芯片比较两组间差异,GO分析提示沉默KIF26A后下调的通路中,有与癌症相关的通路,Pathway分析提示与癌症增殖及细胞周期相关的通路;（2）Western Blot结果提示KIF26A基因沉默组p21的表达明显升高,CDK2/4/6、CyclinD1/E1、pRB和E2F1均有抑制作用,并在KIF26A过表达组中表达相反,在RT-qPCR结果中CyclinE1、CDK2、CDK6表达有显著差异,其他分子改变不明显,表明KIF26A在蛋白水平抑制p21的表达,然后激活CDK-RB-E2Fs通路。5、E2F1可正向调节KIF26A的表达及其下游通路相关分子,形成反馈环路通过RT-qPCR实验证实,沉默E2F1,KIF26A的表达也相应下降,其下游相关分子CyclinD1、CyclinE1、CDK、CDK4、CDK6的表达也不同程度下降,过表达E2F1,这些分子的表达相应的升高,但是p21、pRB的改变无相应的趋势。Western Blot实验显示蛋白水平的改变更为显著,提示可能通过转录后水平影响其下游通路。6、裸鼠成瘤动物实验,证实KIF26A对乳腺癌细胞增殖的作用和机制（1）在裸鼠皮下荷瘤实验中,发现沉默KIF26A基因,抑制乳腺癌细胞生长,且抑制乳腺癌细胞的局部浸润;（2）通过对移植瘤蛋白水平的检测,发现沉默KIF26A基因,CDK-RB-E2F通路相关分子表达下调,与体外验证结果一致。研究结论及意义在本研究中,我们评估了 KIF26A在人乳腺癌组织中的表达,结果表明KIF26A高表达与乳腺癌ER阳性表达、低组织学级别、腋窝淋巴结转移相关。通过细胞功能学实验及体内裸鼠成瘤动物实验,我们证实KIF26A可促进乳腺癌细胞增殖、迁移、浸润和G1/S期细胞周期的进展。通过KIF26A的转录调控机制研究,明确了KIF26A的核心启动子区位于相对于TSS-395/-385bp区域内,E2F1通过与KIF26A启动子区直接结合,发挥正向转录调节作用,激活KIF26A的表达,抑制p21的表达,激活CDK-RB-E2Fs通路,通过反馈环路,促进乳腺癌细胞增殖、细胞周期进展。通过本项目研究,阐明了KIF26A在乳腺癌的生物学功能,明确其转录调节机制,及与功能相关的作用通路,为乳腺癌提供预后指标及可能的治疗靶点。