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研究背景过量的膳食脂肪摄入所致的血脂异常可促进2型糖尿病、心血管疾病、运动系统疾病和多种肿瘤的发生发展,其正在全球范围内持续威胁人类健康。持续性高脂血症,尤其是循环中高甘油三酯（Triglyceride,TG）水平可导致大量脂质在非脂肪组织中异位沉积,进而长期损伤组织器官的功能,最终引起靶器官功能紊乱,这种现象被定义为脂毒性（Lipotoxicity）。近年来,脂毒性已被证明会导致许多器官和组织的功能障碍,据估计其影响约25%的美国成年人。根据我们前期研究发现,脂毒性与垂体-甲状腺轴激素水平之间存在显著相关性,这表明垂体可能是脂毒性的潜在靶器官。然而迄今为止,脂毒性是否会影响垂体生长激素分泌细胞的功能仍未见报道。生长激素（Growth hormone,GH）是一种由垂体前叶合成和分泌的多肽类激素,其生理功能是促进合成代谢和生长。循环中GH水平主要受两种下丘脑神经肽的协同调控,其中生长激素释放激素（GH-releasing hormone,GHRH）促进GH的合成和分泌,而生长抑素（Somatostatin,SS）则具有抑制效应。性别、年龄、体重和营养状态等多种生理和病理因素都可显著改变GH的分泌模式,从而影响其生物学效应的发挥。Pit-1,也称为GHF-1或POU1F1,是GH的垂体特异性转录因子,在GH的转录调控和垂体发育中起主要作用。在人类垂体中,Pit-1基因突变可导致先天性GH缺乏症（GH deficiency,GHD）。基于人群的流行病学调查和动物研究均表明,在高脂饮食诱导体重增加的环境下,循环中GH水平降低。但是,这个过程是由于GH合成下降还是由于GH分泌障碍导致的需要进一步探究。内质网（Endoplasmic reticulum,ER）是细胞内一种重要的细胞器,其在调节分泌蛋白的合成中发挥关键性作用。内质网稳态主要受未折叠蛋白反应（Unfolded protein response,UPR）的调节,这是一个复杂的信号系统来调节转录和翻译以增加ER的蛋白质折叠能力,然而过度和/或长期的UPR激活则会导致细胞损伤甚至凋亡。在心脏等器官中,脂毒性可导致ER功能障碍并激活UPR,引起内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ER stress）从而损伤心脏功能。在内质网应激中发挥重要调控作用的三条信号通路是:肌醇需求激酶-1α（Inositol-requiring enzyme-1α,IRE1α）通路、蛋白激酶样内质网激酶（Protein kinase-like ER kinase,PERK）通路和激活转录因子 6α（Activating transcription factor6α,ATF6α）通路。有趣的是,最近的一些研究表明内质网应激也存在于中枢神经系统中,并参与神经退行性疾病的发生发展。在本研究中,我们探讨了脂毒性对垂体生长激素分泌细胞功能的影响。首先,我们通过一项横断面研究,分析了人群中血清TG与GH水平的相关性;然后,我们观察了高脂饮食大鼠模型血清GH水平的改变,并检测脂毒性导致GH合成关键分子及内质网应激通路相关指标的变化,同时我们也在体外用棕榈酸（Palmitic acid,PA）处理的GH3细胞模型来研究脂毒性对GH合成的直接影响;最后,在大鼠和GH3细胞模型中缓解内质网应激,探讨内质网应激在脂毒性导致垂体GH合成减少中的作用,为脂毒性所致的GH缺乏提供新的治疗思路和策略。研究目的1.明确在人群中血清TG与GH水平的相关性。2.体内研究观察高脂饮食大鼠模型血清GH水平的变化,并检测脂毒性导致GH合成关键分子及内质网应激通路相关指标的改变。3.体外研究通过棕榈酸处理大鼠垂体GH3细胞,观察脂毒性对GH合成关键分子及内质网应激通路相关指标的直接影响。4.建立缓解内质网应激的大鼠和GH3细胞模型,探讨内质网应激在脂毒性导致垂体GH合成减少中的作用。研究方法（一）流行病学调查研究1.研究对象我们在山东省泰安市宁阳县进行了一项横断面研究。所有受试者均超过40岁且在此居住超过5年。按照严格的标准进行纳入排除,并按照年龄、空腹血糖（Fasting plasma glucose,FPG）、HbA1c、收缩压（Systolic blood pressure,SBP）和舒张压（Diastolic blood pressure,DBP）进行分层,最终共有90名男性纳入本研究。2.分析指标测量身高、体重和血压,并通过现场问卷调查获得既往病史信息。所有受试者在晚上12时后禁食,次日上午8-10点采集空腹血。血清TG、总胆固醇（Total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白胆固醇（Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）及FPG用山东省立医院检验科的全自动生化分析仪（OLYMPUS AU5400,Olympus,Japan）及配套试剂测定。血清 HbA1c 应用 Hemoglobin 测试系统（VARIANT Ⅱ,Bio Rad Laboratories,USA）进行检测。血清GH水平用山东省立医院检验科罗氏仪器（Cobas E601;Roche,Basel,Switzerland）进行检测,原装试剂购自罗氏公司。（二）动物及细胞研究1.动物模型高脂饮食大鼠模型:将大鼠于动物房适应性饲养1周后,按照随机数表法分成2组:①普通饮食组（Chow diet,CD,n=20只）:100%基础饲料,3.37 kcal/g;②高脂饮食组（High fat diet,HFD,n=20只）:85%基础饲料+15%猪油,4.14 kcal/g。在饲养第0、4、28周早晨8-10点分别经锁骨下静脉留取空腹静脉血。抑制内质网应激的大鼠模型:将大鼠适应性饲养1周后,按照随机数表法分为4组（每组12只）:①CD+PBS组;②CD+4-PBA组;③HFD+PBS组;④HFD+4-PBA组。于普通或高脂饲料喂养第9周开始注射药物,在保持饲养条件不变的前提下,4-PBA组大鼠每天通过腹腔注射100 mg/kg/d的4-PBA,对照组大鼠每天通过腹腔注射相应剂量的对照溶媒PBS。2.血脂与肝功的评估:高脂造模大鼠血清TG、ALT和AST均由全自动生化分析仪测定。3.血清及培养基上清GH/IGF-1轴激素水平测定:应用ELISA测定大鼠血清或GH3细胞培养基上清中GH和IGF-1的浓度。4.通过GH激发实验评估垂体GH的储备功能:在高脂喂养第28周,大鼠经尾静脉注射5 μg/kg GHRH。检测GHRH注射后第0、8、15、20和30分钟血清GH水平。5.垂体组织内脂质含量测定:应用酶法测定大鼠垂体组织内TG和游离脂肪酸（Free fatty acid,FFA）含量。6.垂体形态学观察:通过H＆E染色及透射电镜,观察大鼠垂体一般病理形态和超微结构的变化。7.GH3细胞内脂质含量评估:通过油红染色观察PA处理后GH3细胞内脂质含量的变化。8.GH合成关键分子mRNA水平的评估:通过Real time-PCR检测GH和Pit-1的mRNA水平变化。9.GH合成关键分子蛋白水平的评估:通过Western Blotting和免疫荧光观察GH和Pit-1的蛋白水平变化。10.内质网应激信号通路的激活水平评估:通过Western Blotting观察BiP、IRE1 α、eIF2α和ATF6α在大鼠垂体组织和GH3细胞中的激活水平变化。11.缓解内质网应激的治疗效果评估:通过给予内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid,4-PBA）或IRE1α通路抑制剂4μ8c,观察内质网应激指标、GH水平及GH合成关键蛋白的变化。（三）统计学方法计量资料均采用均数±标准差来表示。所有数据均采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。应用Spearman相关和多元线性回归评估血清TG和GH水平的相关性。两组间均数的比较采用Student’s t-test,多组间均数的比较采用one-way ANOVA。P＜0.05表示具有统计学差异。研究结果1.在人群中,血清GH水平与TG水平呈负相关。我们通过一项横断面研究发现,在人群中血清基础GH水平与TG水平呈负相关（r=-0.494,P＜0.001）。多元线性回归结果显示,在校正影响GH水平的年龄、BMI、FPG和SBP后,GH与TG的负相关性依然存在（β=-0.279,P=0.009）。2.长期高脂饮食使大鼠体重和血清TG水平增加。自高脂喂养第19周开始,HFD组大鼠体重较CD组明显增加（P＜0.05）;在第28周时,HFD组大鼠血清TG水平相较CD组明显升高（P＜0.01）,此结果表明我们成功建立了高脂饮食诱导的高甘油三酯血症大鼠模型。3.长期高脂饮食降低大鼠血清GH/IGF-1轴激素水平。造模第28周时,HFD组大鼠血清GH水平相较CD组显著降低（P＜0.01）。GH激发实验结果表明高脂饮食可降低大鼠垂体GH分泌细胞的储备功能。在肝功不变的前提下,HFD组大鼠血清IGF-1水平明显降低（P＜0.01）。4.长期高脂饮食增加大鼠垂体内TG和FFA含量,同时伴有垂体形态结构的改变。相较于CD组,HFD组大鼠垂体内TG和FFA含量明显增加（P＜0.05）,这表明脂毒性可能影响垂体。在形态结构方面,H＆E染色结果表明HFD组大鼠垂体内嗜酸性细胞数目减少;电镜结果表明HFD组大鼠垂体内分泌细胞和分泌颗粒均减少。5.脂毒性降低垂体内GH的表达。Real time-PCR和Western Blotting结果显示,高脂喂养28周时大鼠垂体内GH mRNA和蛋白水平均降低,这表明GH合成下降。6.PA处理增加GH3细胞内脂质含量,并伴随GH表达下调。油红染色结果表明PA处理后GH3细胞内脂质含量明显增加,这提示GH3细胞易受脂毒性影响。脂毒性下调GH3细胞中GH mRNA和蛋白表达,并降低培养基上清中GH浓度。7.脂毒性降低GH3细胞和大鼠垂体组织中Pit-1基因的表达。Pit-1是负责GH合成的关键转录因子。Real time-PCR、Western Blotting和免疫荧光的结果显示,在PA处理的GH3细胞和HFD组大鼠的垂体组织中Pit-1 mRNA和蛋白表达下降。这印证了脂毒性可抑制GH合成。8.脂毒性诱发大鼠垂体组织和GH3细胞中内质网应激和IRE1α通路激活。在HFD组大鼠的垂体组织和PA处理的GH3细胞中,BiP的蛋白表达和IRE1α的磷酸化水平明显增加,但是eIF2α和ATF6α的激活水平不变。这提示在垂体GH分泌细胞中,脂毒性可激活内质网应激和IRE1α信号通路。9.内质网应激抑制剂4-PBA可改善高脂饮食大鼠的GH合成功能。对高脂饮食大鼠进行4-PBA处理后,垂体内Pit-1和GH表达升高,血清中GH浓度增加。这表明4-PBA可改善脂毒性导致的GH合成下降。10.阻断内质网应激或IRE1α信号通路可改善GH3细胞中脂毒性导致的GH合成下降。对GH3细胞进行内质网应激抑制剂4-PBA或IRE1α抑制剂4μ8c处理,细胞内和培养基上清中GH含量明显增加。此结果表明内质网应激和IRE1α信号通路在GH合成的调节中发挥重要作用。研究结论1.流行病学调查研究显示,在人群中血清GH水平与TG水平呈负相关。2.脂毒性可直接影响垂体GH分泌细胞,抑制GH的合成功能。3.脂毒性诱发垂体GH分泌细胞中内质网应激和IRE1α通路激活,阻断内质网应激或IRE1α通路可改善脂毒性导致的GH合成下降。