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研究背景早期NSCLC的消融治疗肺癌是全世界范围内发病率排在第二位的恶性肿瘤,它的死亡率排在第一位。2020年,全世界有220万的新诊断病例,有180万的病例死于肺癌。肺癌按组织病理学可分为非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）和小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer,SCLC）,其中NSCLC约占所有肺癌的85%。早期诊断、早期治疗能够明显地改善肺癌患者的预后。引起广泛关注的美国国家肺癌筛查（NLST）和荷兰-比利时肺癌筛查（NELSON）这两项大型试验,表明了低剂量螺旋CT筛查可降低20%肺癌患者的死亡率。低剂量CT筛查已作为肺癌高危人群筛查的重要手段,越来越多的早期肺癌被发现。早期（Ⅰ期及淋巴结阴性的ⅡA期）NSCLC的治疗主要依赖于手术切除,而对于不适宜或者个人意愿不接受手术的患者,立体定向放射治疗（Stereotactic Body Radiation Therapy,SBRT）是作为首选。图像引导的热消融（Thermal Ablation）自2017年后也被National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南推荐用于不可耐受手术切除的早期NSCLC。但是,目前很多研究证明对于不能手术的早期NSCLC,优先推荐SBRT而不是消融。大量的临床研究结果显示,虽然SBRT和消融的1年和3年生存率没有统计学差异（1 年:68.2-95%vs.81-85.7%;3 年:36-87.5%vs.42.7-56%）。但是消融5年的生存率（20.1-27%）却显著低于SBRT（47%）。因此,相对于SBRT,消融的复发率高还是影响其在临床应用的瓶颈。消融相对于SBRT具有可重复性好,无辐射,对肺功能影响小,住院时间短,花费小的优势。如果能降低消融的复发率,提高5年的生存率,可使许多早期NSCLC患者获益。前期研究显示,对于直径小于3cm的NSCLC,热消融治疗与SBRT临床治疗效果相当。但对于直径大于3cm或者形态不规则的早期肺癌,热消融复发率显著升高,5年生存期显著降低。这是因为肿瘤未达到完全灭活所致。受到热刺激但是未死亡的肿瘤细胞会发生哪些生物学改变,这些改变对于预后的影响,是提高早期肺癌消融生存期一个值得去探索的问题。不全消融与亚致死热损伤在原发性肝癌的热消融中,学者们提出不全消融所致亚致死热损伤（Sublethal Heat Damage）的概念。亚致死热损伤定义为37℃到60℃可导致部分肿瘤细胞死亡,而部分肿瘤细胞存活下来,存活下来的细胞出现了一系列的生物学改变。在肝细胞癌的细胞及动物实验证实,在这个温度区间的某个或某几个温度热刺激后,存活下来的细胞会发生上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）,伴随侵袭迁移能力增强。这可能是肝癌消融后复发的关键因素。一项研究将肝癌细胞系经过热暴露后,发现肿瘤细胞形成纺锤状形态,肿瘤干性和EMT指标CD133,CK7,CK19,前胶原-α1（Ⅰ）和Snail表达升高。动物实验也表明热暴露的肝癌细胞移植入裸鼠所诱发的肿瘤生长更快且侵袭性更强。Tan等也得到了类似的结果,在46℃可以导致肝癌细胞系细胞侵袭迁移能力增强。同时该团队建立了肝癌细胞裸鼠移植瘤不全消融模型,发现残留肿瘤转移能力明显升高。Yamada S等同样证实了亚致死温度48℃热刺激下,诱导了肝癌细胞系中N-钙粘蛋白上调,E-钙粘蛋白表达降低。上述一系列的实验证实了亚致死温度确实能导致肿瘤细胞生物学行为的改变,主要是EMT表型上调,侵袭迁移能力增加。亚致死热损伤与NSCLC而在NSCLC消融中,肿瘤复发和转移是否与不全消融导致残余肿瘤细胞恶性生物学行为增加有关,尚没有文献报道。亚致死热损伤如何导致NSCLC细胞发生恶性转化的机制,也还没有人去探索。研究目的本课题从临床上经常碰到的消融不充分而导致复发这一现象出发,通过临床数据回顾得出消融完整的必要性。然后通过体内外实验探索和明确NSCLC的不全消融（亚致死热损伤）会导致残余肿瘤细胞侵袭迁移能力增强并出现EMT的现象。我们推断受到亚致死热损伤刺激的NSCLC是通过EMT导致生物学行为改变的。然后我们通过转录组测序筛选亚致死热损伤后的NSCLC差异表达基因及信号通路,并验证差异表达分子在恶性转化中的作用。目的是通过发现不全消融导致肿瘤恶性转化的机制,来提示临床医师完整消融是降低复发的关键因素。研究方法1.回顾性分析了 36例接受微波消融（Microwave ablation,MWA）的Ⅰ期NSCLC患者,以5mm为界,将患者分为足够消融边界组和消融边界不足两个组。Kaplan-Meier法计算两个组的局部肿瘤进展（Local tumor progression,LTP）间期、远处转移（Distantmetastasis,DM）间期和无病生存期(Disease-free survival,DFS,并通过log-rank法检验。2.采用Cox比例风险模型评价性别、年龄、ECOG评分、病理分型、T分期、肿瘤直径、最小消融边界共7个可能影响患者预后的因素。3.建立小鼠肺癌异种移植瘤模型,成瘤到一定体积后,行不全消融。消融后继续培养10天后处死小鼠,解剖瘤体,苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin,H-E）染色法观察细胞形态变化,免疫组化染色法（Immunohistochemistry,IHC）检测上皮间质转化相关表型表达。4.体外使用37℃-50℃热浴NSCLC细胞株,使用台盼蓝染色法,确定NSCLC细胞株的体外亚致死温度区间。5.亚致死温度热处理2种NSCLC细胞株后,CCK-8法及克隆形成实验检测细胞的增殖能力的变化;流式细胞术检测细胞的在热刺激后细胞周期及凋亡率的变化。6.亚致死温度热处理2种NSCLC细胞系后,通过细胞划痕实验检测细胞的迁移能力;通过Transwell小室实验检测侵袭、迁移能力变化;选择BALB/C Nude裸鼠,尾静脉注射检测亚致死热刺激后的肿瘤细胞的体内转移能力。7.RT-PCR及Western blot检测亚致死温度热处理2种NSCLC细胞株后EMT相关表型的变化。8.通过转录组测序（RNA-Seq）检测热刺激后NSCLC细胞差异基因的表达,筛选出差异表达基因及信号通路。9.亚致死热刺激2株NSCLC细胞株后,RT-PCR和Western blot检测差异基因（Carboxypeptidase A4,CPA4）随时间的变化。10.收集临床NSCLC患者病例,CPA4在肿瘤组织,以及癌旁组织中的表达水平采用IHC检测;根据得出的免疫组化染色评分结果,统计分析CPA4的表达水平,并分析与NSCLC患者临床病理学特征之间的相关性;对NSCLC患者进行随访,并收集资料,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,应用log-rank检验方法,分析CPA4的表达水平与患者生存时间之间的相关关系。11.通过转染建立稳定高表达和低表达的NSCLC细胞系。RT-PCR及Western blot检测CPA4在正常肺上皮细胞系BEAS-2B及4株NSCLC细胞系的表达,筛选出内源性高表达CPA4的细胞株和低表达CPA4的细胞株。选择CPA4表达低的细胞株H1299转染CPA4质粒上调CPA4表达,并通过慢病毒感染建立稳定过表达CPA4的细胞株;选择CPA4高表达的细胞株A549,转染CPA4shRNA干扰CPA4表达,并通过慢病毒感染建立稳定干扰CPA4细胞株。12.CCK-8和平板克隆形成实验检测过表达和沉默CPA4后,对NSCLC的增殖能力影响;流式细胞术检测过表达和沉默CPA4后,NSCLC的细胞周期分布情况;进行细胞划痕实验,Transwell小室检测过表达和沉默CPA4后,分析肿瘤细胞的侵袭迁移能力。13.选择BALB/c Nude裸鼠皮下注射过表达CPA4的NSCLC细胞及其对照组细胞,检测NSCLC成瘤能力;尾静脉注射过表达/干扰CPA4细胞检测肿瘤细胞的体内转移能力。14.通过RT-PCR及Western Blot检测稳定过表达和稳定干扰CPA4的NSCLC细胞系EMT相关表型的变化。15.干扰CPA4后,再通过热刺激NSCLC细胞,Transwell小室侵袭迁移实验检测NSCLC的侵袭、迁移能力变化,通过Annexin V-FITC/PI流式细胞术,检测热刺激对NSCLC凋亡的影响,通过Western blot检测干扰CPA4后热刺激对EMT相关分子表型的影响。研究结果1.最小消融边界和早期NSCLC消融的预后密切相关最小消融边界≥5mm患者的无局部进展间期（LTP interval）及无病生存期（DFS）显著长于最小消融边界＜5mm的患者。单因素和多因素分析显示肿瘤直径（风险比[HR]=1.91,P＜0.01;HR=2.41,P=0.01）和最小消融边界（HR=0.13,P＜0.01;HR=0.11,P＜0.01）为LTP间期的独立预后因素。同时,被认为是影响DFS的独立预后因素:肿瘤直径（HR=1.96,P＜0.01;HR=2.35,P＜0.01）、最小消融边界（HR=0.17,P＜0.01;HR=0.13,P＜0.01）这两个因素。也是。在我们的回顾性分析中,有50%（18/36）的患者消融边界不到5mm。以上研究的这些患者,被认为是肺癌复发的高危人群。2.动物实验中,不全消融可以导致残余肿瘤病灶EMT相关表型表达升高不全消融组肿瘤体积明显小于对照组。HE染色观察到细胞出现坏死,是发生在进行消融的核心区,坏死的细胞其中大部分细胞结构破坏,仅见有组织轮廓,细胞核碎裂,核固缩。而核心区周围细胞呈梭形变化,同时细胞之间变得松散,可能导致EMT转化。免疫组化检测了 EMT相关的分子表型变化,与对照组相比,残留肿瘤中上皮相关分子E-cadherin表达明显降低,间质相关分子N-cadherin、Vimentin表达显著上调。3.热刺激后的存活率随着温度的升高而降低根据台盼蓝染色的结果,我们定义体外的亚致死温度区间在37℃-48℃,热暴露时间为10min。4.46℃和48℃亚致死热刺激可抑制体外NSCLC细胞增殖,增加细胞凋亡在体外,通过CCK-8及平板克隆实验,46℃和48℃亚致死热刺激可抑制NSCLC细胞增殖,而低于46℃对增殖没有显著影响。Annexin V-FITC/PI流式细胞术显示,46℃和48℃增加了细胞凋亡,而42℃和44℃对NSCLC凋亡没有显著影响。5.46℃和48℃亚致死热刺激会导致G0/G1期阻滞细胞周期检测显示,42℃和44℃对肺癌细胞细胞周期没有显著影响。而46℃和48℃导致NSCLC细胞在G0/G1周期阻滞。6.44℃和46℃亚致死热刺激可增强体外NSCLC细胞的侵袭和迁移能力细胞划痕实验显示,在44℃和46℃热刺激后72h的NSCLC,其迁移能力显著增强。Transwell小室侵袭迁移实验也证实了 44℃和46℃热刺激后72h的NSCLC细胞的侵袭迁移能力显著增强。7.44℃和46℃热刺激的后肺癌细胞株体内转移能力增强尾静脉注射实验验证了 44℃和46℃热刺激的肺癌细胞小鼠的肝肺转移灶数量显著高度对照组。8.在体外,44℃和46℃热刺激诱导了非小细胞肺癌EMT相关表型表达升高RT-PCR显示在44℃和46℃热刺激后,48h EMT的转录因子表达开始上升,72h表达最高。其中44℃组升高最为显著。44℃和46℃热刺激后,western blot结果显示E-cadherin蛋白表达显著下调,N-cadherin和Vimentin表达显著上调。44℃热刺激后72h时N-cadherin和Vimentin表达升高最为显著。9.RNA-Seq发现热刺激后CPA4表达升高转录组测序发现亚致死热损伤后CPA4显著差异表达（P＜0.01）,EMT相关基因显著富集。RT-PCR和Western blot验证了44℃热刺激可以升高CPA4,且呈时间依赖性。热刺激后,CPA4从8h开始表达上调,到48h达到最高,72h开始下降。10.CPA4在NSCLC中高表达,且与预后差密切相关CPA4在NSCLC组织内表达高于癌旁组织,且高表达CPA4的NSCLC患者预后更差。CPA4表达阳性的非小细胞肺癌患者生存时间较CPA4表达阴性的患者其生存时间明显缩短（14.4月VS.22.2月）。此外,CPA4的表达水平还与三个因素密切相关,分别是肿瘤分化程度（P=0.03）、临床分期（P=0.02）和淋巴结转移（P=0.01）。11.CPA4促进NSCLC细胞体外增殖及侵袭迁移RT-PCR及Western blot检测结果显示:在4株NSCLC细胞株（A549、H1299、H1975及PC9）中CPA4均有所表达,这4株细胞株中,H1299最低,A549最高。过表达CPA4后,出现明显增强的是H1299细胞的增殖及侵袭迁移能力;干扰CPA4后,受到明显抑制的是A549细胞的增殖及侵袭迁移能力。12.CPA4促进NSCLC细胞体内成瘤能力及体内转移能力我们建立了皮下移植瘤模型,从中发现过表达CPA4后,肿瘤生长的速度显著快于对照组,且肿瘤的体积大于对照组。尾静脉注射模型发现,过表达CPA4后,裸鼠肺组织转移灶数目显著多于对照组;干扰CPA4后,裸鼠肺组织转移灶数目少于对照组。13.CPA4过表达诱导NSCLC细胞的EMT通过RT-PCR和Western blot检测了过表达CPA4的H1299细胞,上皮细胞黏附分子E-cadherin表达显著下降,间质的表型N-cadherin和Vimentin表达显著提高;敲低CPA4后的A549细胞,E-cadherin表达显著上升,而间质表型N-cadherin和Vimentin表达下降。免疫组化检测过表达CPA4的H1299细胞的皮下瘤组织,相对于对照组,E-cadherin表达显著下降,N-cadherin和Vimentin表达上升。14.敲低CPA4可部分逆转亚致死热刺激引起的NSCLC的恶性生物学行为和EMT敲低CPA4后,再使用44℃热刺激肺癌细胞株,结果发现,相对于空白的NSCLC细胞株,敲低CPA4后接受热刺激的肺癌细胞株,侵袭迁移能力仍出现增加,但是增加的程度相对于没有敲低CPA4但接受热刺激的肺癌细胞显著降低。提示沉默CPA4可以部分逆转亚致死热损伤导致的侵袭、迁移能力增强。敲低CPA4后,再使用44℃热刺激肺癌细胞株,结果发现,干扰CPA4后,相对于无热刺激的空白组,E-cadherin表达显著下降,N-cadherin和Vimentin表达上升,但相对于热刺激组E-cadherin表达显著上升,N-cadherin和Vimentin表达下降。说明沉默CPA4可以部分逆转亚致死热损伤导致的EMT。15.沉默CPA4可增加A549和H1975热刺激后细胞凋亡干扰CPA4后,A549和H1975细胞对热损伤更加敏感,凋亡率显著增加。结论1.消融的边界与早期NSCLC的预后密切相关,早期NSCLC的消融必须要达到安全的消融边界,最小边界不应小于5mm。2.消融不足引起的亚致死热刺激可增强NSCLC细胞侵袭、迁移能力,其机制为亚致死热损伤诱导了 NSCLC的EMT。体外研究结果显示44℃和46℃这两个亚致死温度是出现恶性转化的扳机温度（Trigger temperature）,其中44℃诱导出的表型更为显著。3.消融不足可以诱导CPA4表达上调,CPA4作为一种癌基因,与NSCLC患者预后密切相关。高表达CPA4肿瘤患者生存期更短,过表达CPA4的NSCLC细胞株侵袭、迁移能力更强。4.CPA4在亚致死热损伤导致肺癌细胞出现恶性转化中起到关键作用。干扰CPA4可以部分逆转亚致死热刺激导致的EMT和侵袭迁移能力增强。因此,无论是将CPA4作为一种肿瘤标记物判断消融是否完全或者作为消融后随访的监测指标,亦或者靶向CPA4处理消融不全导致的复发,都为我们以后的工作开展了思路。