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局灶节段性肾小球硬化（Focal segmental glomerulosclerosis,FSGS）是儿童和成人肾病综合征（Nephrotic syndrome,NS）常见的病理表型,是导致终末期肾病（End Stage renal disease,ESRD）的主要病因之一。足细胞是一种高度分化的上皮细胞,与肾小球内皮细胞以及GBM共同构成肾小球的滤过屏障。足细胞损伤是FSGS的主要特征,因此,寻找有效治疗和改善足细胞损伤的靶点对于FSGS的治疗具有重要的临床意义。PRRs包括表达在膜上的C型凝集素受体（C-type lectin receptor,CLR）和Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）;表达在胞质的 NOD 样受体（NOD-like receptor,NLR）、RIG-I样受体（RIG-I-likereceptor,RLR）和多种DNA感应分子等。在肾脏疾病发病过程中,肾脏细胞及免疫细胞中的模式识别受体可被激活并启动主要的天然免疫通路,如NF-κB和NLRP3炎症小体,并触发多种炎症介质的分泌,导致不可逆的组织损伤和功能紊乱。例如TLR4、TLR5、NOD2等可通过调控足细胞炎症反应影响肾脏疾病的发病进程。然而CLRs在肾脏疾病足细胞损伤中的作用仍不清楚。TLRs和CLRs是两类主要的模式识别受体,研究表明TLRs信号传导的关键中间体TRAF6和TAK1也是CLRs抗真菌免疫反应中下游信号通路的关键成分。基于TLRs在肾脏疾病中的重要作用,我们猜测CLRs也在肾脏疾病中也发挥重要作用。通过前期的基因芯片数据分析,我们聚焦于 CLEC14A（C-type lectin family 14A）的研究。CLEC14A 是 CLR 超家族14亚家族中的一员。近期研究发现,在胚胎发育过程中CLEC14A特异性地表达于血管内皮细胞,参与调控VEGF信号通路并促进肿瘤的血管生成。另有研究表明CLEC14A可通过负调控VEGFR-2抑制缺血造成的神经元炎症反应并提高血脑屏障的完整性。由于炎症反应以及VEGFR-2信号通路都参与了肾脏疾病的发生发展过程,提示CLEC14A可能与肾脏疾病进展的关键调控通路有关。目前虽然针对于PRRs中的Toll样受体与NOD样受体在肾脏及足细胞损伤中的作用取得了一定研究进展,但是关于CLRs在肾脏疾病中的功能方面的研究非常少,尚未有关于CLRs在足细胞的生物学功能方面的报道。因此,本课题重点关注CLEC14A在足细胞损伤中的功能,揭示了其在调控足细胞骨架结构、炎症反应及粘附等方面中的作用。我们首次发现CLEC14A在阿霉素诱导的FSGS小鼠肾脏中表达降低。与此一致,在多种足细胞病患者肾活检标本中CLEC14A的表达也降低。进一步实验发现,敲除CLEC14A明显加重阿霉素诱导的FSGS小鼠的足细胞损伤和蛋白尿生成,并伴随炎症细胞浸润及炎症反应增加。在机制上,我们首次发现CLEC14A可与HMGB1（high mobility group box-1 protein）结合并抑制其分泌,进而抑制HMGB1介导的炎症反应,EGR1（early growth response protein 1）通路的激活等。本研究进一步充实了对CLEC14A生物学功能的新认识,并为FSGS的防治提供了新的靶点和思路,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。研究目的（1）明确CLEC14A在阿霉素肾病中的表达变化。（2）揭示CLEC14A在阿霉素肾病足细胞损伤中的作用。（3）探讨CLEC14A在足细胞损伤中的作用机制,为探索阿霉素肾病及其他足细胞病的治疗策略提供新的思路。研究方法第一部分:明确CLEC14A在阿霉素肾病中的表达变化1.1 检测临床病人肾组织标本中CLEC14A的表达变化（1）收集伴有蛋白尿的肾小球疾病包括FSGS、微小病变肾病（minimal change disease,MCD）、糖尿病肾病（diabetic kidney disease,DKD）及膜性肾病（membranous nephropathy,MN）患者的肾穿刺活检标本的病理切片。（2）免疫组化（immuohistochemical,IHC）检测CLEC14A在肾脏中的分布和表达变化。1.2 阿霉素肾病动物模型中CLEC14A表达变化（1）构建阿霉素肾病动物模型:对8周龄小鼠尾静脉注射阿霉素（Adriamycin,ADR）,注射剂量为20mg/kg,5周后留取肾脏标本。（2）琼脂糖凝胶实验检测CLEC14A在小鼠各组织中的表达情况。（3）检测肾脏中CLEC14A的表达与定位情况:①Western blot检测肾皮质中CLEC14A的蛋白表达水平。②用免疫磁珠法分离肾小球,RT-qPCR检测肾小球中CLEC14A的mRNA水平。③IHC检测CLEC14A在肾小球中的分布和表达变化。④CLEC14A和足细胞标记蛋白Synaptopodin免疫荧光双标,激光共聚焦技术观察肾小球中CLEC14A的细胞定位和表达变化。1.3 体外模拟阿霉素肾病条件检测各种肾脏实质细胞中CLEC14A的表达变化（1）Western blot检测CLEC14A在肾脏实质细胞中表达情况。（2）分别给予0.4νg/mL的ADR处理肾小球足细胞（human podocyte,HPC）、内皮细胞（glomerular endothelial cell,GENC）、系膜细胞（mesangial cell,MC）,Western blot 检测CLEC14A的表达变化。第二部分:揭示CLEC14A在阿霉素肾病足细胞损伤中的作用2.1 构建CLEC14A敲除小鼠的阿霉素肾病动物模型（1）提取鼠尾DNA鉴定小鼠基因型。（2）动物模型构建:构建ADR诱导的Clec14a-/-小鼠阿霉素肾病模型,注射剂量为20mg/kg。（3）验证CLEC14A在肾脏中的敲除效率:①实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测Clec14a-/-及WT 小 鼠肾脏皮质中 CLEC14A 的 mRNA 水平变化。②免疫荧光（immunofluorescence,IF）检测CLEC14A在肾脏中的表达变化。2.2 揭示CLEC14A在阿霉素肾病足细胞损伤中的作用2.2.1 检测敲除CLEC14A对阿霉素素肾病足细胞损伤及蛋白尿的影响（1）检测尿白蛋白/肌酐比（urinary albumin creatinine ratio,UACR）。（2）检测血肌酐（serum creatinine,Scr）。（3）过碘酸雪夫氏染色（periodic acid-schiff stain,PAS）检测肾小球形态变化和硬化程度。（4）应用透射电镜（transmissionelectronmicroscopy,TEM）观察足突数量、足突融合、肾小球基底膜（glomerular basement membrane,GBM）厚度等。（5）IF检测肾小球足细胞裂孔隔膜蛋白Podocin和Nephrin的表达变化。2.2.2检测敲除CLEC14A对阿霉素肾病肾脏炎症反应的影响（1）RT-qPCR 检测肾脏皮质中 IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α 的 mRNA 水平变化。（2）IF检测巨噬细胞标志物CD68和中性粒细胞标志物Ly6B的表达变化。2.3 体内过表达CLEC14A验证其在肾脏疾病中的作用2.3.1 CLEC14A过表达小鼠模型的构建（1）对8周龄小鼠进行肾脏实质注射携带Clec14a基因的慢病毒载体（pGLV3-Clec14a）或对照慢病毒载体（pGLV3-1null,1×105IU/μl）,1天后尾静脉注射阿霉素,造模5周后留取肾脏标本。（2）验证CLEC14A在肾脏中的过表达效率:Western blot检测pGLV3-Clec14a组及pGLV3-null组小鼠肾脏皮质中CLEC14A的蛋白水平。2.3.2检测体内过表达CLEC14A对阿霉素肾病足细胞损伤、蛋白尿、肾脏炎症反应的影响（1）检测UACR和Scr水平。（2）PAS检测肾小球形态变化和硬化程度。（3）TEM观察足突数量、足突融合、GBM厚度等。（4）IF检测足细胞损伤后肾小球足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin和Podocin的表达变化。（5）RT-qPCR检测肾脏皮质中的IL-1β、MCP-1、TNF-α的表达变化。2.4 检测CLEC14A基因过表达对阿霉素诱导的体外培养的足细胞损伤的影响（1）使用携带pCMV6-Clec14a质粒的重组腺病毒载体及其对照载体（pCMV6-null）转染体外培养的足细胞,Western blot验证CLEC14A过表达效率。（2）采用阿霉素（0.4μg/mL）刺激足细胞24h,RT-qPCR检测炎症因子的表达变化。（3）用Casepase3活性检测试剂盒检测足细胞凋亡情况。（4）流式细胞术检测足细胞死亡情况。（5）Western blot 检测足细胞损伤因子 uPAR（urokinase-type plasminogen activor receptor）的表达变化。（6）RT-qPCR检测足细胞损伤因子uPAR的mRNA水平变化。（7）细胞IF检测足细胞中β3整合素的活性。（8）Western blot检测足细胞裂孔隔膜蛋白Podocin和Nephrin的表达变化。（9）F-actin荧光染色后,激光共聚焦显微镜观察足细胞骨架重排。第三部分:探讨CLEC14A在阿霉素肾病足细胞损伤中的作用机制3.1检测足细胞内CLEC14A与HMGB1的相互作用研究表明CLEC14A同家族分子血栓调节蛋白与HMGB1结合并抑制其下游炎症反应,我们检测了 CLEC14A与HMGB1的结合情况以及ADR刺激条件下HMGB1的表达和分布情况。（1）用阿霉素（0.4μg/mL）刺激足细胞24h,Western blot检测HMGB1的表达变化。（2）用阿霉素（0.4μg/mL）刺激足细胞24h,细胞IF检测HMGB1的表达和分布变化。（3）足细胞过表达CLEC14A,用阿霉素（0.4μg/mL）刺激足细胞24h,丽春红染色结合Western blot检测HMGB1的分泌变化。（4）免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）检测过表达CLEC14A对阿霉素处理的足细胞中CLEC14A与HMGB1的结合水平的影响。3.2 检测CLEC14A对HMGB1下游信号通路的影响3.2.1 检测CLEC14A对HMGB1介导的炎症反应的影响（1）用携带Clec14a过表达质粒的腺病毒载体转染足细胞过表达CLEC14A,再用重组蛋白rHMGB1刺激足细胞,Western blot检测足细胞中p65的表达及转位。（2）足细胞过表达CLEC14A后,用重组蛋白rHMGB1刺激足细胞,RT-qPCR检测足细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平变化。3.2.2 利用基因芯片技术分析CLEC14A下游信号通路基因芯片用于分析组间差异表达基因,检测CLEC14A基因过表达对阿霉素诱导的足细胞内下游基因的影响。3.2.3 检测足细胞内CLEC14A对HMGB1/EGR1通路的调控（1）用携带Clec14a过表达质粒的腺病毒载体转染足细胞过表达CLEC14A,Western blot检测阿霉素处理的足细胞中EGR1的表达变化。（2）足细胞转染HMGB1的小干扰RNA后沉默HMGB1,Western blot检测HMGB1的沉默效率。（3）足细胞转染HMGB1的小干扰RNA后沉默HMGB1,Western blot检测阿霉素处理的足细胞中EGR1的表达变化。（4）用携带Clec14a过表达质粒的腺病毒载体转染足细胞过表达CLEC14A,再用重组蛋白rHMGB1刺激足细胞,Western blot检测足细胞中EGR1的表达变化。3.3 验证EGR1是否介导CLEC14A缺失导致的足细胞损伤3.3.1 检测基因沉默EGR1对CLEC14A缺失导致的足细胞损伤的影响（1）足细胞转染CLEC14A的小干扰RNA后沉默CLEC14A,Western blot检测CLEC14A的沉默效率。（2）足细胞转染EGR1的小干扰RNA后沉默EGR1,Western blot检测EGR1的沉默效率。（3）足细胞分别转染Si-NC、Si-CLEC14A或同时转染Si-CLEC14A和Si-EGR1小干扰RNA,RT-qPCR检测阿霉素处理的足细胞中IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α的mRNA水平变化。（4）足细胞分别转染Si-NC、Si-CLEC14A或同时转染Si-CLEC14A和Si-EGR1小干扰RNA,流式细胞术检测阿霉素刺激下足细胞死亡情况。（5）足细胞分别转染Si-NC、Si-CLEC14A或同时转染Si-CLEC14A和Si-EGR1小干扰RNA,Western blot检测阿霉素处理的足细胞中Nephrin和Podocin的表达变化。（6）足细胞分别转染Si-NC、Si-CLEC14A或同时转染Si-CLEC14A和Si-EGR1小干扰RNA,F-actin荧光染色激光共聚焦观察阿霉素刺激下足细胞骨架重排。（7）足细胞分别转染Si-NC、Si-CLEC14A或同时转染Si-CLEC14A和Si-EGR1小干扰RNA,RT-qPCR检测阿霉素处理的足细胞中uPAR的mRNA水平。3.3.2 检测敲除CLEC14A对阿霉素肾病小鼠中EGR1及下游uPAR信号通路的影响（1）RT-qPCR检测肾脏皮质中EGR1的mRNA水平变化。（2）IHC检测肾小球中EGR1的表达变化。（3）RT-qPCR检测肾脏皮质中uPAR的mRNA水平变化。（4）IHC检测肾小球中uPAR的表达变化。（5）IHC检测肾小球中β3整合素的活性变化。（6）IF检测足细胞标记蛋白WT1的表达变化验证肾小球中足细胞的死亡情况。3.3.3 检测体内过表达CLEC14A对阿霉素肾病小鼠肾小球中EGR1的表达水平的影响IHC检测肾小球中EGR1的表达变化。研究结果第一部分:CLEC14A在阿霉素肾病小鼠肾脏及多种足细胞病患者肾活检中的表达1.1 多种足细胞病患者肾活检中CLEC14A的表达变化肾活检样本免疫组织化学结果显示:与肾癌旁正常组织相比,FSGS、MN、DKD和MCD患者的肾小球中CLEC14A表达显著降低。1.2 阿霉素肾病动物模型中CLEC14A的表达变化（1）琼脂糖凝胶实验结果显示:CLEC14A在肾脏中有相对较高水平的表达。（2）Western blot、免疫组化结果显示:与对照组小鼠相比,阿霉素肾病小鼠肾皮质中CLEC14A的蛋白表达均显著降低,且主要集中在肾小球。（3）免疫磁珠法分离肾小球,光学显微镜下观察具有代表性的肾小球样品纯度大于98%,肾小球样品纯度高且未被肾小管碎片污染。RT-qPCR结果显示:与对照组小鼠相比,阿霉素肾病小鼠肾小球中CLEC14A的mRNA水平显著降低。（4）CLEC14A与Synaptopodin免疫荧光共定位结果显示:与对照组小鼠相比,阿霉素肾病小鼠足细胞中CLEC14A表达显著降低。1.3 体外模拟阿霉素肾病条件检测各种肾脏实质细胞中CLEC14A的表达变化（1）Western blot结果显示:CLEC14A在肾脏各实质细胞中都有表达。（2）与对照组相比,ADR诱导的足细胞中CLEC14A表达显著降低。然而,用ADR刺激肾小球内皮细胞和系膜细胞,CLEC14A表达无显著变化。第二部分:CLEC14A在阿霉素肾病足细胞损伤中的作用2.1 构建CLEC14A敲除小鼠的FSGS模型（1）提取鼠尾DNA鉴定小鼠基因型,结果显示:Clec14a-/-小鼠是敲除CLEC14A的纯和基因型小鼠。（2）IF结果显示:与WT组小鼠相比,Clec14a-/-小鼠肾脏中CLEC14A的表达显著降低。（3）RT-qPCR检测结果显示:与WT组小鼠相比,Clec14a-/-小鼠肾皮质中CLEC14A mRNA水平显著下调,进一步证实CLEC14A敲除小鼠构建成功。2.2 敲除CLEC14A加重阿霉素肾病肾脏损伤2.2.1 敲除CLEC14A加重阿霉素肾病足细胞损伤、加重蛋白尿（1）与对照组小鼠相比,ADR模型小鼠的尿白蛋白排泄增加,血肌酐水平增加。CLEC14A敲除小鼠相较于WT组小鼠体型更小,血管再生能力明显减弱,尿白蛋白未出现显著变化。ADR诱导的Clec14a-/-小鼠的尿白蛋白排泄明显加重。（2）阿霉素肾病小鼠形态学实验显示,敲除CLEC14A进一步加重阿霉素肾病小鼠肾小球系膜基质增生,GBM增厚、足突数量减少及足突宽度增加。（3）Western blot、IF结果显示:与对照组小鼠相比,ADR小鼠肾小球中Nephrin和Podocin表达降低,ADR诱导的Clec14a-/-小鼠Nephrin和Podocin表达进一步降低。2.2.2 敲除CLEC14A加重肾脏炎症反应（1）RT-qPCR检测结果显示:敲除CLEC14A加重阿霉素肾病小鼠肾皮质炎症反应。（2）IF结果显示:敲除CLEC14A加重阿霉素肾病小鼠肾小球中巨噬细胞及中性粒细胞的浸润。2.3 过表达CLEC14A减轻阿霉素肾病CLEC14A敲除小鼠肾脏损伤2.3.1 构建CLEC14A肾脏过表达小鼠Western blot检测结果显示:与WT小鼠相比,CLEC14A过表达小鼠肾皮质中CLEC14A蛋白表达水平显著升高。证实CLEC14A过表达小鼠构建成功。2.3.2 CLEC14A高表达减轻CLEC14A敲除所加剧的阿霉素肾病（1）过表达CLEC14A可改善阿霉素肾病CLEC14A敲除（ADR/Clec14a-/-）小鼠UACR增加。（2）过表达CLEC14A可改善ADR/Clec14a-/-小鼠Scr增加。（3）阿霉素肾病小鼠形态学实验显示,过表达CLEC14A可减轻ADR/Clec14a-/-小鼠肾小球系膜基质增生,GBM增厚、足突数量减少及足突宽度增加,改善足细胞损伤。（4）IF结果显示:过表达CLEC14A可恢复ADR/Clec14a-/-小鼠足细胞中Nephrin和Podocin的表达水平。（5）RT-qPCR检测结果表明,过表达CLEC14A可下调ADR/Clec14a-/-小鼠肾皮质中炎症因子IL-1β、MCP-1、TNF-α的表达水平。2.4 过表达CLEC14A可改善阿霉素诱导的足细胞损伤（1）Western blot验证CLEC14A过表达效率,结果显示CLEC14A过表达效果显著。（2）RT-qPCR检测结果显示:过表达CLEC14A可抑制ADR诱导的足细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α 的表达。（3）CLEC14A可减轻ADR诱导的足细胞死亡,改善足细胞骨架重排。（4）Western blot和RT-qPCR检测结果显示:过表达CLEC14A可改善ADR诱导的uPAR的表达增加。（5）IF结果显示:过表达CLEC14A可改善ADR诱导的β3整合素的活性增加。（6）Western blot结果显示:过表达CLEC14A可改善ADR诱导的Nephrin和Podocin的损失。第三部分:CLEC14A在阿霉素肾病足细胞损伤中的作用机制3.1 足细胞内CLEC14A直接结合HMGB1并抑制其分泌（1）Western blot结果显示:与对照组相比,在ADR诱导的足细胞中,HMGB1的蛋白水平无显著变化。（2）IF结果显示:ADR诱导足细胞中的HMGB1从细胞核转移到细胞质。（3）Western blot结果显示:ADR诱导足细胞中的HMGB1分泌到细胞外,过表达CLEC14A可抑制其分泌。（4）Co-IP检测结果显示:与对照组相比,ADR刺激条件下足细胞中CLEC14A与HMGB1的蛋白结合水平显著降低。过表达CLEC14A可恢复其结合水平。3.2 足细胞内CLEC14A抑制HMGB1下游信号通路3.2.1 CLEC14A抑制HMGB1下游炎症反应（1）Western blot结果显示:足细胞中过表达CLEC14A可抑制rHMGB1诱导的NF-κB p65的活性。（2）RT-qPCR检测结果表明,足细胞中过表达CLEC14A可抑制rHMGB1诱导的足细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。3.2.2 利用基因芯片技术分析CLEC14A下游信号通路通过分析基因芯片结果,我们发现足细胞内过表达CLEC14A下调ADR诱导的转录因子EGR1的mRNA水平。3.2.3 足细胞内CLEC14A通过HMGB1抑制EGR1的表达（1）Western blot结果显示:足细胞中过表达CLEC14A可抑制ADR诱导的EGR1的表达。（2）Western blot验证HMGB1沉默效率,结果显示HMGB1沉默效果显著。（3）Western blot结果显示:足细胞中沉默HMGB1基因可抑制ADR诱导的EGR1的表达。（4）Western blot结果显示:足细胞中过表达CLEC14A可抑制rHMGB1诱导的EGR1的表达。说明CLEC14A通过HMGB1调控EGR1的表达。3.3 EGR1及下游uPAR信号通路介导了 CLEC14A缺失导致的足细胞损伤3.3.1 抑制EGR1可改善CLEC14A缺失导致的足细胞损伤（1）Western blot验证EGR1沉默效率,结果显示EGR1沉默效果显著。（2）Western blot验证CLEC14A沉默效率,结果显示CLEC14A沉默效果显著。（3）RT-qPCR检测结果显示:ADR处理的足细胞中沉默EGR1可改善CLEC14A基因沉默所引起的IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α的表达增加。说明CLEC14A通过EGR1调控炎症反应。（4）流式细胞术和F-actin荧光染色检测结果显示:ADR处理的足细胞中沉默EGR1可改善CLEC14A基因沉默所引起的细胞死亡和细胞骨架重排。（5）Western blot结果显示:ADR处理的足细胞中沉默EGR1可改善CLEC14A基因缺失所引起的Podocin和Nephrin的损失。（6）RT-qPCR检测结果显示:ADR处理的足细胞中沉默EGR1可改善CLEC14A基因缺失所引起的uPAR的表达升高。3.3.2敲除CLEC14A上调阿霉素肾病小鼠肾皮质中EGR1及下游uPAR信号通路（1）RT-qPCR检测结果显示:敲除CLEC14A上调阿霉素肾病小鼠肾皮质中EGR1的表达水平。（2）IHC结果显示:敲除CLEC14A上调阿霉素肾病小鼠肾小球中EGR1的表达水平。（3）RT-qPCR检测结果显示:敲除CLEC14A上调阿霉素肾病小鼠肾皮质中uPAR的表达水平。（4）IHC结果显示:敲除CLEC14A上调阿霉素肾病小鼠肾小球中uPAR的表达水平。（5）IHC结果显示:敲除CLEC14A增加阿霉素肾病小鼠肾小球中β3整合素的活性。（6）IF结果显示:敲除CLEC14A加重阿霉素肾病小鼠足细胞死亡。3.3.3过表达CLEC14A下调阿霉素肾病小鼠肾小球中EGR1的表达水平IHC结果显示:过表达CLEC14A可下调ADR/Clec1 4a-/-小鼠肾小球中EGR1的表达水平。结论及创新性1.本课题首次发现CLEC14A在足细胞损伤肾病患者肾小球中显著降低,在阿霉素诱导的FSGS小鼠模型中表达水平明显下调。2.本课题首次发现敲除CLEC14A显著加重FSGS小鼠足细胞损伤及蛋白尿生成,进一步发现基因过表达CLEC14A可以改善阿霉素诱导的足细胞损伤。3.本课题首次发现CLEC14A通过调控HMGB1/EGR1信号通路作用于FSGS足细胞损伤,为FSGS及相关肾小球疾病的防治提供了新的治疗靶点与实验基础。