论文部分内容阅读
转基因鸡输卵管生物反应器具有高产蛋能力，转基因鸡群快速扩繁能力和与人类相似的蛋白糖基化形式，在药用蛋白生产方面具有不可替代的作用。到目前为止，相继建立了鸡蛋卵白（eggwhite）中表达干扰素、溶菌酶、抗体、促红细胞生成素、表皮生长因子等重组蛋白的转基因鸡。但是对于不同长度卵清蛋白启动子（OVP）活性，以及雌激素应答元件（ERE）和卵清蛋白上游启动子转录因子（COUP-TF）调控作用缺乏系统研究；其次，作为外源基因转移的有效载体，鸡原始生殖细胞（PGCs）分离培养方法也待探讨。本研究的目的是确定鸡OVP核心区域，筛选高转录活性的OVP;探讨ERE和COUP-TF调控作用；摸索鸡PGCs适宜培养方法；通过体外和体内验证试验，确定可望用于制备输卵管生物反应器的OVP。
1.CRISPR-dCas9-VP64介导的鸡卵清蛋白启动子转录活性分析。
将启动子cERE-cOVP-2785、cOVP-2785分别亚克隆至pGL3-Basic载体，构建了荧光素酶表达载体pGL3-cERE-cOVP-2785、pGL3-cOVP-2785。利用LipofectamineTM2000将上述2个质粒以及pGL3cOVP-1548分别与pRL-TK质粒共转染293T细胞，检测荧光素酶活性，评估三个启动子的转录活性。利用在线软件OptimizedCRISPRDesign，依据鸡卵清蛋白（OVA）基因第一内含子、转录起始位点上游区域DNA序列，共设计11对sgRNA；依据鸡ERE序列设计了2对sgRNA,分别构建了11个pGL3-U6-OVPsgRNA和2个pGL3-U6-EREsgRNA重组质粒；将pGL3-cERE-cOVP-2785、pcDNA-dCas9或pcDNA-dCas9-VP64质粒分别与单个或多个sgRNA表达质粒共转染293T细胞，检测荧光素酶活性，评估启动子和ERE对荧光素酶表达的影响。结果表明，（1）cERE-cOVP-2785启动子片段的转录活性最高，cOVP-2785次之;（2）dCas9-VP64对荧光素酶激活效应强于dCas9；（3）多个sgRNA引导的dCas9-VP64转录激活效应优于单个sgRNA;(4)第1内含子和转录起始位点上游以及ERE区域每个sgRNA均能靶向激活荧光素酶表达。（5）培养液中添加雌激素显著提升荧光素酶表达水平。
2.鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅰ/Ⅱ（COUP-TFⅠ/Ⅱ）功能分析。
构建pcDNA3.1-HisC-COUP-TFⅠ及pcDNA3.1-HisC-COUP-TFⅡ重组质粒，利用LipofectamineTM2000分别或共同将pcDNA3.1-HisC-COUP-TFⅠ和pcDNA3.1-HisC-COUP-TFⅡ与pGL3-cERE-cOVP-2785或pGL3-cOVP-2785以及pRL-TK质粒共转染293T细胞，检测荧光素酶活性，以此评估COUP-TFⅠ/Ⅱ对荧光素酶表达调控作用。结果表明，（1）COUP-TFI/II与cERE-OVP2785联合作用，上调荧光素酶表达，发挥正调控作用；（2）COUP-TF I/II与OVP2785联合作用，下调荧光素酶表达，呈现负调控作用；（3）COUP-TFI和COUP-TFII两个转录因子发挥协同作用，调控荧光素酶表达，且COUP-TFⅡ调控作用大于COUP-TFⅠ。
3.鸡原始生殖细胞（PGCs）的分离及培养。
分别采用Ficoll密度梯度离心法和酶消化法从HH-14期鸡胚血液和HH-28期鸡胚性腺中分离PGCs，分别接种至BRL、STO和CEF饲养层上，比较PGCs增殖能力，并对其生物学特性加以鉴定；此外，对DMSO和乙二醇的冻存效能进行了对比研究。结果表明，（1）来自性腺的PGCs(gPGCs)增殖能力优于来自血液的PGCs(bPGCs)；（2）以BRL为饲养层，在培养基中添加40%BRL条件培养液和细胞因子SCF（6ng/mL）、bFGF（4ng/mL）和LIF（10TU/mL），可以使PGCs连续培养100天以上，是鸡PGCs培养的优选方法；（3）鸡PGCs对PAS和AKP染色，以及SSEA-1免疫荧光染色均呈现阳性反应，在体外分化培养时能形成类胚体;（4）与10%DMSO相比，用10％乙二醇冻存的鸡PGCs复苏后成活率较高，是鸡PGCs适宜的冻存剂。
4.鸡卵清蛋白启动子体内外功能验证。
采用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，将慢病毒载体pLenti6.4/cERE-cOVP-2785/cSLP-EGFP与包装质粒psPAX2和pMD2.G以及pRSV-Rev共转染293T细胞，超速离心法浓缩慢病毒，LaSRT法测定慢病毒滴度。慢病毒体外感染鸡OECs、鸡性腺PGCs以及293T细胞，以EGFP表达效率体外验证cERE-cOVP-2785功能；慢病毒注射2.5日龄鸡胚背主动脉，换壳培养，直至出壳。荧光蛋白手电筒和配套滤镜观察鸡胚性腺EGFP表达效率，PCR检测EGFP整合效率，体内验证cERE-cOVP-2785功能。结果表明，（1）EGFP在鸡OECs、性腺PGCs均有表达，但在293T细胞中没有表达，说明该启动子具有组织特异性；（2）EGFP在鸡胚性腺中表达，且EGFP可整合宿主性腺基因组，表明cERE-cOVP-2785能有效驱动外源基因在性腺中表达，但转基因表达稳定性尚需进一步验证。
结论：卵清蛋白基因转录起始位点上游-54~-807bp区域和第1内含子均为卵清蛋白启动子核心序列；cERE-cOVP-2785是适宜的卵清蛋白启动子，因为其转录活性高，ERE具有增强子作用；COUP-TFⅠ/Ⅱ与cERE-cOVP-2785，对下游基因发挥正调控作用；以BRL为饲养层，在培养基中添加40%BRL条件培养液和细胞因子SCF（6ng/mL）、bFGF（4ng/mL）和LIF（10TU/mL），是鸡gPGCs培养的优选方法；启动子cERE-cOVP-2785可以有效驱动EGFP体外和体内特异性表达，有望用于输卵管特异性表达转基因鸡研究。
1.CRISPR-dCas9-VP64介导的鸡卵清蛋白启动子转录活性分析。
将启动子cERE-cOVP-2785、cOVP-2785分别亚克隆至pGL3-Basic载体，构建了荧光素酶表达载体pGL3-cERE-cOVP-2785、pGL3-cOVP-2785。利用LipofectamineTM2000将上述2个质粒以及pGL3cOVP-1548分别与pRL-TK质粒共转染293T细胞，检测荧光素酶活性，评估三个启动子的转录活性。利用在线软件OptimizedCRISPRDesign，依据鸡卵清蛋白（OVA）基因第一内含子、转录起始位点上游区域DNA序列，共设计11对sgRNA；依据鸡ERE序列设计了2对sgRNA,分别构建了11个pGL3-U6-OVPsgRNA和2个pGL3-U6-EREsgRNA重组质粒；将pGL3-cERE-cOVP-2785、pcDNA-dCas9或pcDNA-dCas9-VP64质粒分别与单个或多个sgRNA表达质粒共转染293T细胞，检测荧光素酶活性，评估启动子和ERE对荧光素酶表达的影响。结果表明，（1）cERE-cOVP-2785启动子片段的转录活性最高，cOVP-2785次之;（2）dCas9-VP64对荧光素酶激活效应强于dCas9；（3）多个sgRNA引导的dCas9-VP64转录激活效应优于单个sgRNA;(4)第1内含子和转录起始位点上游以及ERE区域每个sgRNA均能靶向激活荧光素酶表达。（5）培养液中添加雌激素显著提升荧光素酶表达水平。
2.鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅰ/Ⅱ（COUP-TFⅠ/Ⅱ）功能分析。
构建pcDNA3.1-HisC-COUP-TFⅠ及pcDNA3.1-HisC-COUP-TFⅡ重组质粒，利用LipofectamineTM2000分别或共同将pcDNA3.1-HisC-COUP-TFⅠ和pcDNA3.1-HisC-COUP-TFⅡ与pGL3-cERE-cOVP-2785或pGL3-cOVP-2785以及pRL-TK质粒共转染293T细胞，检测荧光素酶活性，以此评估COUP-TFⅠ/Ⅱ对荧光素酶表达调控作用。结果表明，（1）COUP-TFI/II与cERE-OVP2785联合作用，上调荧光素酶表达，发挥正调控作用；（2）COUP-TF I/II与OVP2785联合作用，下调荧光素酶表达，呈现负调控作用；（3）COUP-TFI和COUP-TFII两个转录因子发挥协同作用，调控荧光素酶表达，且COUP-TFⅡ调控作用大于COUP-TFⅠ。
3.鸡原始生殖细胞（PGCs）的分离及培养。
分别采用Ficoll密度梯度离心法和酶消化法从HH-14期鸡胚血液和HH-28期鸡胚性腺中分离PGCs，分别接种至BRL、STO和CEF饲养层上，比较PGCs增殖能力，并对其生物学特性加以鉴定；此外，对DMSO和乙二醇的冻存效能进行了对比研究。结果表明，（1）来自性腺的PGCs(gPGCs)增殖能力优于来自血液的PGCs(bPGCs)；（2）以BRL为饲养层，在培养基中添加40%BRL条件培养液和细胞因子SCF（6ng/mL）、bFGF（4ng/mL）和LIF（10TU/mL），可以使PGCs连续培养100天以上，是鸡PGCs培养的优选方法；（3）鸡PGCs对PAS和AKP染色，以及SSEA-1免疫荧光染色均呈现阳性反应，在体外分化培养时能形成类胚体;（4）与10%DMSO相比，用10％乙二醇冻存的鸡PGCs复苏后成活率较高，是鸡PGCs适宜的冻存剂。
4.鸡卵清蛋白启动子体内外功能验证。
采用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，将慢病毒载体pLenti6.4/cERE-cOVP-2785/cSLP-EGFP与包装质粒psPAX2和pMD2.G以及pRSV-Rev共转染293T细胞，超速离心法浓缩慢病毒，LaSRT法测定慢病毒滴度。慢病毒体外感染鸡OECs、鸡性腺PGCs以及293T细胞，以EGFP表达效率体外验证cERE-cOVP-2785功能；慢病毒注射2.5日龄鸡胚背主动脉，换壳培养，直至出壳。荧光蛋白手电筒和配套滤镜观察鸡胚性腺EGFP表达效率，PCR检测EGFP整合效率，体内验证cERE-cOVP-2785功能。结果表明，（1）EGFP在鸡OECs、性腺PGCs均有表达，但在293T细胞中没有表达，说明该启动子具有组织特异性；（2）EGFP在鸡胚性腺中表达，且EGFP可整合宿主性腺基因组，表明cERE-cOVP-2785能有效驱动外源基因在性腺中表达，但转基因表达稳定性尚需进一步验证。
结论：卵清蛋白基因转录起始位点上游-54~-807bp区域和第1内含子均为卵清蛋白启动子核心序列；cERE-cOVP-2785是适宜的卵清蛋白启动子，因为其转录活性高，ERE具有增强子作用；COUP-TFⅠ/Ⅱ与cERE-cOVP-2785，对下游基因发挥正调控作用；以BRL为饲养层，在培养基中添加40%BRL条件培养液和细胞因子SCF（6ng/mL）、bFGF（4ng/mL）和LIF（10TU/mL），是鸡gPGCs培养的优选方法；启动子cERE-cOVP-2785可以有效驱动EGFP体外和体内特异性表达，有望用于输卵管特异性表达转基因鸡研究。