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近年来，猪博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)在世界范围内养殖场广泛感染，流行病学调查研究发现，该病毒与猪群腹泻和呼吸困难有一定的相关性，可能对养猪生产造成重大危害，但目前尚不清楚其致病性和致病机理。本研究主要内容如下：
1.将GenBank公布的PBoV序列分为3个大的基因群(G1群、G2群、G3群)，分别针对每个基因群建立特异性PCR方法，对来自6个地区的样品进行检测，结果发现PBoV在有腹泻症状的猪体内阳性率(48.4%)明显高于健康猪(11.1%)，在广东、湖南、辽宁等地区间阳性率差异不明显；PBoV与2型猪圆环病毒(68.8%)、A群轮状病毒(35.6%)和流行性腹泻病毒(23.8%)混合感染较普遍；组织检测发现，肺和小肠的阳性率最高，颌下淋巴结阳性率较低，肝脏最低；G1群、G3群PBoV的感染受季节影响较大，冬季明显高于夏季，而G2群的感染受季节影响较小；G1群PBoV的感染受年龄影响较大，断奶仔猪的阳性率(64.2%)明显高于育肥猪(30.0%)，而G2群和G3群PBoV的感染受年龄影响较小。
2.对11份PBoV阳性样品进行全基因序列测定，序列分析表明不同基因群病毒基因序列差异较大，基因变异率较高；同一基因群内基因序列同源性较高，但点突变较明显。系统遗传进化分析表明序列主要处于3个相对独立的大分支上，G1群和G2群的病毒序列相对保守，而且亲缘关系较近，而G3群序列变异率较高，处于一个独立的大分支上。依据2018版国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)的分类方法将11株PBoV划分为5个基因型，分别属于Ungulatebocaparvovirus2(UBoV2)型、Ungulatebocaparvovirus3(UBoV3)型、Ungulatebocaparvovirus5(UBoV5)型和2个新的基因型。应用RDP4软件进行基因重组分析，发现其中1株病毒(GD23)的NS1基因存在重组区域(nt925-1959)，而且两个亲本均来自美国株。
3.对PBoV结构蛋白独有序列(Unique redion of VP1，VP1u)进行分析，SWISS-MODEL软件预测其三级结构，结果表明GDZ1株、GD18株的VP1u十分相似，与GD4株差别较大。分别对GDZ1的VP1u氨基酸序列21位(P→R)、41位(H→A)和42位(D→N)进行突变，并对VP1u序列及其突变序列进行原核表达，表达蛋白稀释到0.5mg/mL后应用磷脂酶A2(sPLA2)试剂盒检测酶活性，结果表明GDZ1株的VP1u具有sPLA2活性，而突变序列几乎丧失了酶活性。
4.筛选出不同基因型的病毒株GD4(G1)、GD18(G2)和GDZ1(G3)，以105拷贝/μL的病毒量感染35日龄健康断奶仔猪，比较研究3个病毒株感染仔猪后的临床症状、病理变化，结果表明病毒GD4株、GD18株感染猪出现轻微咳嗽和轻微稀便，GDZ1株感染猪第10天出现较严重腹泻，第26天一头猪死亡。应用建立的特异性QPCR方法检测唾液拭子、粪便，病毒主要经粪便持续排出，分别在第7天左右和第18天左右有两个排毒小高峰。对GD4株、GD18株和GDZ1株病毒抗原性较好的VP1截短序列进行原核表达，蛋白经鉴定、纯化后免疫小鼠，制备多克隆抗体，抗体效价均在1:12800。提取主要脏器组织进行QPCR检测、制备组织切片(HE染色)、免疫组织化学分析，结果表明，GD4组织嗜性最强为肺和大脑，GD18最强是胃，其次为肠，GDZ1最强是大肠、小肠，其次为胃。出现病理变化的主要组织是肝、肺、小肠、大脑和脾，此外GDZ1在胃有变化。GD18和GDZ1株在肺支气管、肾集合管、胃、小肠、大肠等组织上皮细胞有强阳性信号；GD4株在大脑神经元、肺支气管和肾集合管上皮细胞有强阳性信号，在小肠和大肠上皮细胞有弱阳性信号。
综上所述，本研究比较分析了3个群(G1、G2、G3)PBoV分子流行病学、基因组特征、基因重组及VP1u序列的磷脂酶A2活性，筛选出3个基因型的病毒株(GD4、GD18、GDZ1)分别感染健康仔猪，比较病毒的组织嗜性、组织病理变化、侵染部位，表明PBoV具有一定的致病能力，为进一步研究PBoV的致病性和感染的分子机制提供一定的参考和理论基础。
1.将GenBank公布的PBoV序列分为3个大的基因群(G1群、G2群、G3群)，分别针对每个基因群建立特异性PCR方法，对来自6个地区的样品进行检测，结果发现PBoV在有腹泻症状的猪体内阳性率(48.4%)明显高于健康猪(11.1%)，在广东、湖南、辽宁等地区间阳性率差异不明显；PBoV与2型猪圆环病毒(68.8%)、A群轮状病毒(35.6%)和流行性腹泻病毒(23.8%)混合感染较普遍；组织检测发现，肺和小肠的阳性率最高，颌下淋巴结阳性率较低，肝脏最低；G1群、G3群PBoV的感染受季节影响较大，冬季明显高于夏季，而G2群的感染受季节影响较小；G1群PBoV的感染受年龄影响较大，断奶仔猪的阳性率(64.2%)明显高于育肥猪(30.0%)，而G2群和G3群PBoV的感染受年龄影响较小。
2.对11份PBoV阳性样品进行全基因序列测定，序列分析表明不同基因群病毒基因序列差异较大，基因变异率较高；同一基因群内基因序列同源性较高，但点突变较明显。系统遗传进化分析表明序列主要处于3个相对独立的大分支上，G1群和G2群的病毒序列相对保守，而且亲缘关系较近，而G3群序列变异率较高，处于一个独立的大分支上。依据2018版国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)的分类方法将11株PBoV划分为5个基因型，分别属于Ungulatebocaparvovirus2(UBoV2)型、Ungulatebocaparvovirus3(UBoV3)型、Ungulatebocaparvovirus5(UBoV5)型和2个新的基因型。应用RDP4软件进行基因重组分析，发现其中1株病毒(GD23)的NS1基因存在重组区域(nt925-1959)，而且两个亲本均来自美国株。
3.对PBoV结构蛋白独有序列(Unique redion of VP1，VP1u)进行分析，SWISS-MODEL软件预测其三级结构，结果表明GDZ1株、GD18株的VP1u十分相似，与GD4株差别较大。分别对GDZ1的VP1u氨基酸序列21位(P→R)、41位(H→A)和42位(D→N)进行突变，并对VP1u序列及其突变序列进行原核表达，表达蛋白稀释到0.5mg/mL后应用磷脂酶A2(sPLA2)试剂盒检测酶活性，结果表明GDZ1株的VP1u具有sPLA2活性，而突变序列几乎丧失了酶活性。
4.筛选出不同基因型的病毒株GD4(G1)、GD18(G2)和GDZ1(G3)，以105拷贝/μL的病毒量感染35日龄健康断奶仔猪，比较研究3个病毒株感染仔猪后的临床症状、病理变化，结果表明病毒GD4株、GD18株感染猪出现轻微咳嗽和轻微稀便，GDZ1株感染猪第10天出现较严重腹泻，第26天一头猪死亡。应用建立的特异性QPCR方法检测唾液拭子、粪便，病毒主要经粪便持续排出，分别在第7天左右和第18天左右有两个排毒小高峰。对GD4株、GD18株和GDZ1株病毒抗原性较好的VP1截短序列进行原核表达，蛋白经鉴定、纯化后免疫小鼠，制备多克隆抗体，抗体效价均在1:12800。提取主要脏器组织进行QPCR检测、制备组织切片(HE染色)、免疫组织化学分析，结果表明，GD4组织嗜性最强为肺和大脑，GD18最强是胃，其次为肠，GDZ1最强是大肠、小肠，其次为胃。出现病理变化的主要组织是肝、肺、小肠、大脑和脾，此外GDZ1在胃有变化。GD18和GDZ1株在肺支气管、肾集合管、胃、小肠、大肠等组织上皮细胞有强阳性信号；GD4株在大脑神经元、肺支气管和肾集合管上皮细胞有强阳性信号，在小肠和大肠上皮细胞有弱阳性信号。
综上所述，本研究比较分析了3个群(G1、G2、G3)PBoV分子流行病学、基因组特征、基因重组及VP1u序列的磷脂酶A2活性，筛选出3个基因型的病毒株(GD4、GD18、GDZ1)分别感染健康仔猪，比较病毒的组织嗜性、组织病理变化、侵染部位，表明PBoV具有一定的致病能力，为进一步研究PBoV的致病性和感染的分子机制提供一定的参考和理论基础。