虎源猫细小病毒JL-1株的分离鉴定及其LAMP-LFD方法的建立和初步应用

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猫细小病毒病又称猫泛白细胞减少症(Feline panleukopenia, FP),是由猫细小病毒(Feline panleukopenia virus, FPV)引起的一种猫科动物的高度接触性致死性传染病。该病典型临床症状主要为白细胞严重减少和出血性肠炎。目前,该病在世界范围内流行,主要易感动物是猫,也可感染除猫以外几乎所有的猫科、鼬科、浣熊科等家养及野生动物,严重威胁了家养宠物猫及多种珍稀野生虎、豹、狮等动物的健康。自我国首次报道云豹、非洲幼狮、华南虎感染FPV的案例以来,有越来越多的学者从多种患病野生动物的组织中分离出猫细小病毒株。而且,FPV的感染宿主范围已由猫科动物扩大至非人灵长类。因此,建立一种新型猫细小病毒病诊断方法对预防及控制FP在我国的流行具有重要的意义。
  本研究从吉林省野生动物救护繁育中心一例疑似患细小病毒病虎的粪便中分离到1株病毒,在F81细胞上盲传至5代,可观察到明显的细胞病变。对该病毒株进行PCR检测、血凝及血凝抑制试验、电镜负染观察以及全基因序列测序等鉴定试验,证实该毒株为FPV,暂命名为FPVJL-12019CHINA株。对该分离株的全基因组序列进行克隆和测定,利用DNAstar软件对分离株与GenBank上公布的FPV、犬细小病毒(CPV)、水貂肠炎病毒(MEV)以及其他野生动物共45株细小病毒的全基因序列进行分析,发现FPVJL-12019CHINA株与其余44株细小病毒的核苷酸序列的同源性为98.3%~99.9%,氨基酸序列的同源性为92.3%~99.7%。本研究根据已发表的GenBank上的FPV序列设计筛选出1组LAMP引物与LFD探针,建立了一种LAMP-LFD检测方法。对LAMP-LFD反应各条件的优化结果表明,LAMP-LFD反应温度为60℃,反应时间为60min,最低检测限为5个拷贝的核酸,灵敏性是传统PCR方法的100倍,与猫杯状病毒(FCV)、猫疱疹病毒(FHV)、猫轮状病毒(FRV)、犬瘟热病毒(CDV)进行特异性试验,结果均呈阴性,说明特异性较高。之后利用建立的LAMP-LFD试纸条检测吉林、长春、天津、北京共52份圈养虎及杭州、成都、贵阳、苏州共121份猫的新鲜粪便样品,其中圈养虎粪便样品的总阳性率为5.77%,猫新鲜粪便样品的总阳性率为10.74%,表明不同的地区、性别、日龄及采集年份的圈养虎与猫均有FPV感染。
  本研究从长春地区分离到1株虎源FPVJL-12019CHINA株,其生物学特性分析结果表明,FPVJL-12019CHINA株符合FPV耐酸、耐碱、耐氯仿等基本生物学特点;虎源FPV全基因组序列与猫源及其它野生动物FPV的核苷酸序列同源性较高,表明FPV宿主范围逐渐增大,且可能发生跨宿主传播;本研究建立的LAMP-LFD检测方法灵敏度高、特异性强,可适用于虎源以及其它野生动物FPV的现场检测。本研究不仅为虎源FPV的病原特征、流行病学调查提供资料,还为虎源FPV和其它野生动物FPV之间的演化研究提供数据支持。
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