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伪狂犬病新疫情在我国各地相继发生和流行，发病猪场造成巨大经济损失。新的流行毒株的抗原性发生了明显变异，现有弱毒疫苗不能对流行毒株提供完全保护。因此，研制针对PRV变异株的疫苗十分必要，这将对控制我国PRV变异株的流行、减少养猪业的损失乃至对伪狂犬病的净化起到重要作用。本研究通过现地分离到一株PRV变异毒株(命名为伪狂犬病病毒HLJZD-14株)，对其进行了详细的鉴定。在此基础上通过逐步降低培养温度与药物筛选的方法在Vero-E6细胞上连续传代，获得一株gE/TK基因缺失的病毒(猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK株)。随后对该毒株的安全性与免疫原性等开展进一步的研究，以期用于猪伪狂犬活疫苗制苗用的疫苗株。
1猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK的培育
将分离自发病猪脑组织的伪狂犬病病毒HLJZD-14株接种Vero-E6细胞，在逐步降低培养温度的情况下连续传代，从F119代开始进行噬斑克隆，在F135代时筛选获得一个gE基因缺失的病毒，将该病毒纯化并盲传至F145代，通过PCR和间接免疫荧光试验证实gE基因稳定缺失。随后，在细胞培养液中添加40mg/LBrdU的情况下，将HLJZD-14株F145代病毒在LM-TK-细胞传代至F150代，通过噬斑筛选获得了一个TK基因部分缺失的病毒，经过3代噬斑克隆纯化并传代至F160代后命名为猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK株。为方便研究，我们将之命名为种子批F1代，并进行连续传代。
2猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK种子批的纯净性研究
以猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK株F14代种毒接种Vero细胞，连续传代至F30代，按照现行《中华人民共和国兽药典》规定方法，对F14、F19与F20代毒种进行无菌检验和外源病毒检验，结果表明细菌和支原体检验阴性，现行《中华人民共和国兽药典》规定检测的外源病毒也全部为阴性，表明毒种纯净。3猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK安全性研究
以猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TKF1株F14、F19与F20代种毒，经皮下肌肉大剂量接种与21日龄健康仔猪，免疫后观察14日，每天测定各组试验猪体温，观察各组试验猪的采食、饮水、精神状态是否正常，是否出现不良临床反应至，观察期结束，剖杀所有存活猪，并对淋巴结、肾脏、脾脏、扁桃体、膀胱、肺脏、回盲瓣等进行重点观察。结果显示：试验猪与对照猪体温均处于正常生理范围内，采食、饮水及精神状态均正常，均未出现不良临床反应，剖杀后接种猪与对照猪各组织器官均无病理变化。
4猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK免疫原性研究
以猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK株F14代种毒接种Vero细胞，连续进行6次传代至F20代，通过对不同代次种毒的病毒含量的测定，及对21日龄健康仔猪的免疫原性测定结果表明：不同代次种毒的病毒含量在108.0~108.5TCID50/ml之间，最小免疫剂量为肌肉注射104.0TCID50/ml。表明HLJZD-14-delgE/TK株免疫原性良好。因此确定F14代为原始种子批，基础种子代次范围为F15-F19根据免疫实验结果及其它因素综合考虑，确定HLJZD-14-delgE/TK株的免疫剂量为每头份不小于105.0TCID50。另外，与弱毒株BarthaK61株相比，该病毒HLJZD-14-delgE/TK对当前的变异株PRV-HLJZD-14能够提供完全的攻毒保护，而经典株不能提供完全保护。
5生产工艺及中试生产
对猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK株的繁殖和冻干工艺进行了初步研究，并在农业部GMP认证的生产车间进行了5批次的中试生产和检验，进一步验证猪伪狂犬基因工程活疫苗生产工艺，为规模化生产奠定了重要基础。
1猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK的培育
将分离自发病猪脑组织的伪狂犬病病毒HLJZD-14株接种Vero-E6细胞，在逐步降低培养温度的情况下连续传代，从F119代开始进行噬斑克隆，在F135代时筛选获得一个gE基因缺失的病毒，将该病毒纯化并盲传至F145代，通过PCR和间接免疫荧光试验证实gE基因稳定缺失。随后，在细胞培养液中添加40mg/LBrdU的情况下，将HLJZD-14株F145代病毒在LM-TK-细胞传代至F150代，通过噬斑筛选获得了一个TK基因部分缺失的病毒，经过3代噬斑克隆纯化并传代至F160代后命名为猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK株。为方便研究，我们将之命名为种子批F1代，并进行连续传代。
2猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK种子批的纯净性研究
以猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK株F14代种毒接种Vero细胞，连续传代至F30代，按照现行《中华人民共和国兽药典》规定方法，对F14、F19与F20代毒种进行无菌检验和外源病毒检验，结果表明细菌和支原体检验阴性，现行《中华人民共和国兽药典》规定检测的外源病毒也全部为阴性，表明毒种纯净。3猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK安全性研究
以猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TKF1株F14、F19与F20代种毒，经皮下肌肉大剂量接种与21日龄健康仔猪，免疫后观察14日，每天测定各组试验猪体温，观察各组试验猪的采食、饮水、精神状态是否正常，是否出现不良临床反应至，观察期结束，剖杀所有存活猪，并对淋巴结、肾脏、脾脏、扁桃体、膀胱、肺脏、回盲瓣等进行重点观察。结果显示：试验猪与对照猪体温均处于正常生理范围内，采食、饮水及精神状态均正常，均未出现不良临床反应，剖杀后接种猪与对照猪各组织器官均无病理变化。
4猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK免疫原性研究
以猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK株F14代种毒接种Vero细胞，连续进行6次传代至F20代，通过对不同代次种毒的病毒含量的测定，及对21日龄健康仔猪的免疫原性测定结果表明：不同代次种毒的病毒含量在108.0~108.5TCID50/ml之间，最小免疫剂量为肌肉注射104.0TCID50/ml。表明HLJZD-14-delgE/TK株免疫原性良好。因此确定F14代为原始种子批，基础种子代次范围为F15-F19根据免疫实验结果及其它因素综合考虑，确定HLJZD-14-delgE/TK株的免疫剂量为每头份不小于105.0TCID50。另外，与弱毒株BarthaK61株相比，该病毒HLJZD-14-delgE/TK对当前的变异株PRV-HLJZD-14能够提供完全的攻毒保护，而经典株不能提供完全保护。
5生产工艺及中试生产
对猪伪狂犬病病毒HLJZD-14-delgE/TK株的繁殖和冻干工艺进行了初步研究，并在农业部GMP认证的生产车间进行了5批次的中试生产和检验，进一步验证猪伪狂犬基因工程活疫苗生产工艺，为规模化生产奠定了重要基础。