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2015年以来禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype4，FAdV-4)感染导致3-5周龄鸡严重的肝炎-心包积液综合征(Hydropericardium syndrome，HHS)。此后，该病在全国乃至全球多个国家均有流行报导。但是，我们对FAdV-4的了解还有待深入研究，特别是对其感染肝脏的致病机理仍知之甚少。因此，本研究采用转录组学技术，以期探明FAdV-4感染肝脏的分子机制，研究结果可为科学防控该病提供重要的理论依据。
本研究共分为3部分：
1．本研究针对新分离鉴定的FAdV-4NP株Hexon基因的保守序列设计一对特异引物，通过优化荧光定量PCR(QPCR)反应体系，并分析其特异性、敏感性、重复性以及临床样品初步应用。
2．为了探索FAdV-4感染肝脏的分子机制，本试验选择7日龄肉鸡，0.5mL FAdV4（TCID50=10-5.625/O.1mL）的剂量进行攻毒，1天后无菌采集肝脏，送生物公司进行转录组测序，GO和KEGG分析。
3．为了探讨调控FAdV-4在细胞内运输的关键基因，本研究选择KEGG的吞噬通路作为重点研究对象，选择该通路中的CR3，αMβ2，αVβ3,α2β1,MR,F-actin,Rab7,TUBA,DVnein,VATPase,VAMP-3,MHCI和MHCII，SRB1等差异表达基因，进行QPCR验证。接着，选择LMH细胞系，FAdV-4感染，QPCR验证关键基因在的mRNA表达水平。最后，采用RNAi技术分别沉默F-actin，Rab7，TUBA，DVnein这四个关键基因，探讨其对病毒增殖的影响。
结果表明：
1．本试验建立的QPCR检测方法方法特异性强，除FAdV4NP株外均无其他非特异扩增；此外，该方法敏感度高，其检测下限为53.9copies/μL;组内、组间变异系数均小于5%，重复性好。临床样品检测结果显示，建立的QPCR方法的FAdV4NP株检出率为56.5%，远高于常规PCR的检出率(21.7%)。可见，本试验成功建立了一种快速、灵敏的检测Ⅰ群鸡腺病毒血清4型(FAdV4)NP株的方法。
2．FAdV-4感染肉鸡肝脏的转录组测序结果显示，共筛选到13576个差异表达基因(Differential gene expression，DEGs)，其中上调基因7480个，下调基因6096个。GO富集分析结果表明，这些差异表达基因参与了52种生物学功能，其中，“细胞过程”、“细胞”、“结合”等基因所富集到差异基因的数目分别在生物过程、细胞组成、分子过程这3大功能中是最高的。KEGG代谢通路分析表明，共筛选到33条差异代谢通路，差异表达转录本参与的最主要途径是生化代谢途径和信号转导途径。
3．通过KEGG分析吞噬通路，我们发现该途径中有25个DEGs的mRNA上调，7个DEGs下调。随机筛选差异基因进行肝脏水平的验证，结果显示，CR3、αMβ2、αVβ3、MR、F-actin、Rab7、TUBA、DVnein、VAMP-3、VATPase、MHCⅠ、MHCⅡ等差异基因的mRNA水平是上调的，SRB1的mRNA水平下调，其结果与KEGG分析一致。FAdV-4感染LMH细胞，QPCR结果表明F-actin、Rab7、DVnein、TUBA等基因的mRNA水平显著上调。分别沉默F-actin、Rab7、DVnein、TUBA基因，结果显示：当沉默F-actin基因时，Rab7，DVnein、TUBA基因的mRNA水平也发生下调，病毒载量也发生下调。沉默Rab7基因时，F-actin的mRNA水平保持不变，DVnein、TUBA基因的mRNA水平下调，病毒载量也下调。当沉默DVnein时，病毒载量和TUBA的mRNA水平发生下调。沉默TUBA时，FAdV-4的病毒载量下降。这些结果进一步表明，KEGG的吞噬通路中的F-actin，Rab7，DVnein、TUBA基因是FAdV-4入侵并致肝脏损伤密切相关。
综上所述，以FAdV-4NP株Hexon基因序列设计的引物，所建立的QPCR检测方法，特异性强，可以快速检测HHS。另外，我们通过转录组分析发现了大量差异表达基因，这些基因将为FAdV-4感染鸡肝脏的致病机理提供重要的分子基础。研究还发现吞噬通路中的F-actin，Rab7、DVnein、TUBA基因能够调控FAdV-4在肝细胞中的增殖。
本研究共分为3部分：
1．本研究针对新分离鉴定的FAdV-4NP株Hexon基因的保守序列设计一对特异引物，通过优化荧光定量PCR(QPCR)反应体系，并分析其特异性、敏感性、重复性以及临床样品初步应用。
2．为了探索FAdV-4感染肝脏的分子机制，本试验选择7日龄肉鸡，0.5mL FAdV4（TCID50=10-5.625/O.1mL）的剂量进行攻毒，1天后无菌采集肝脏，送生物公司进行转录组测序，GO和KEGG分析。
3．为了探讨调控FAdV-4在细胞内运输的关键基因，本研究选择KEGG的吞噬通路作为重点研究对象，选择该通路中的CR3，αMβ2，αVβ3,α2β1,MR,F-actin,Rab7,TUBA,DVnein,VATPase,VAMP-3,MHCI和MHCII，SRB1等差异表达基因，进行QPCR验证。接着，选择LMH细胞系，FAdV-4感染，QPCR验证关键基因在的mRNA表达水平。最后，采用RNAi技术分别沉默F-actin，Rab7，TUBA，DVnein这四个关键基因，探讨其对病毒增殖的影响。
结果表明：
1．本试验建立的QPCR检测方法方法特异性强，除FAdV4NP株外均无其他非特异扩增；此外，该方法敏感度高，其检测下限为53.9copies/μL;组内、组间变异系数均小于5%，重复性好。临床样品检测结果显示，建立的QPCR方法的FAdV4NP株检出率为56.5%，远高于常规PCR的检出率(21.7%)。可见，本试验成功建立了一种快速、灵敏的检测Ⅰ群鸡腺病毒血清4型(FAdV4)NP株的方法。
2．FAdV-4感染肉鸡肝脏的转录组测序结果显示，共筛选到13576个差异表达基因(Differential gene expression，DEGs)，其中上调基因7480个，下调基因6096个。GO富集分析结果表明，这些差异表达基因参与了52种生物学功能，其中，“细胞过程”、“细胞”、“结合”等基因所富集到差异基因的数目分别在生物过程、细胞组成、分子过程这3大功能中是最高的。KEGG代谢通路分析表明，共筛选到33条差异代谢通路，差异表达转录本参与的最主要途径是生化代谢途径和信号转导途径。
3．通过KEGG分析吞噬通路，我们发现该途径中有25个DEGs的mRNA上调，7个DEGs下调。随机筛选差异基因进行肝脏水平的验证，结果显示，CR3、αMβ2、αVβ3、MR、F-actin、Rab7、TUBA、DVnein、VAMP-3、VATPase、MHCⅠ、MHCⅡ等差异基因的mRNA水平是上调的，SRB1的mRNA水平下调，其结果与KEGG分析一致。FAdV-4感染LMH细胞，QPCR结果表明F-actin、Rab7、DVnein、TUBA等基因的mRNA水平显著上调。分别沉默F-actin、Rab7、DVnein、TUBA基因，结果显示：当沉默F-actin基因时，Rab7，DVnein、TUBA基因的mRNA水平也发生下调，病毒载量也发生下调。沉默Rab7基因时，F-actin的mRNA水平保持不变，DVnein、TUBA基因的mRNA水平下调，病毒载量也下调。当沉默DVnein时，病毒载量和TUBA的mRNA水平发生下调。沉默TUBA时，FAdV-4的病毒载量下降。这些结果进一步表明，KEGG的吞噬通路中的F-actin，Rab7，DVnein、TUBA基因是FAdV-4入侵并致肝脏损伤密切相关。
综上所述，以FAdV-4NP株Hexon基因序列设计的引物，所建立的QPCR检测方法，特异性强，可以快速检测HHS。另外，我们通过转录组分析发现了大量差异表达基因，这些基因将为FAdV-4感染鸡肝脏的致病机理提供重要的分子基础。研究还发现吞噬通路中的F-actin，Rab7、DVnein、TUBA基因能够调控FAdV-4在肝细胞中的增殖。