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鸡球虫病是由一种或多种艾美耳球虫寄生于肠上皮细胞内引起的一种原虫病，不同种的球虫具有宿主及寄生部位的特异性，寄生部位不一样，其致病力也不相同，柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella, E.tenella)寄生于鸡盲肠，致病性最强。乳酸菌等其他益生菌作为抗原递送载体是目前健康养殖与疾病防控的首选，但是乳酸菌外源蛋白表达量低，载体需进一步优化，而且载体的多数研究仍是建立在抗生素标记筛选基础上，存在抗生素基因漂移风险，不利于产业化推广应用，因此构建无抗筛选标记表并表达多蛋白载体十分必要。本研究以天冬氨酸-β半醛脱氢酶(asd)基因和丙氨酸消旋酶基因(alanine racemase gene，alr)作为无抗筛选标记，构建乳酸菌共锚定表达载体系统，将柔嫩艾美耳球虫SO7和EtMIC2抗原共锚定表达在植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum, L. plantarum)NC8/Δalr表面，获得的菌株免疫雏鸡后评价对柔嫩艾美耳球虫的保护作用。本研究将为减少化学抗球虫药物使用，提高动物性食品安全保护人体健康提供保障。具体研究内容及结果如下：
(1)基于asd-alr基因无抗筛选表达载体受体系统NC8/Δalr/409ata构建
首先采用自杀质粒pNZ5319/pNZ5348将植物乳杆菌NC8基因组内的alr基因敲除，获得alr基因缺失株NC8/Δalr，代替野生型植物乳杆菌NC8作为alr标记载体的宿主菌；采用天冬氨酸-β半醛脱氢酶(asd)基因缺陷大肠杆菌(E.coliχ6212)作为无抗性标记质粒构建中间宿主菌，将诱导型大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pSIP409-pgsA’-IL-10的红霉素标记基因(erythromycin resistance gene， erm)用asd-alr基因替换，采用选择性培养，菌落PCR和Westernblots鉴定表明erm基因被替换，成功构建无抗筛选表达载体受体系NC8/Δalr/409ata。
(2)以asd-alr为非抗性筛选标记共锚定表达载体构建
以来源于嗜酸乳杆菌S-层蛋白的锚定序列S-anchoring和枯草芽孢杆菌膜蛋白锚定序列pgsA’为锚定表达框，分别构建以erm为筛选标记单锚定表达载体pLp-S和pLp-pgsA’，以asd-alr为筛选标记分别构建无抗标记锚定表达载体pLQa-S和pLQa-pgsA’。以EGFP为模式蛋白，构建erm标记锚定表达质粒pLp-EGFP-S和pLp-pgsA’-EGFP，以及asd-alr标记的锚定表达质粒pLQa-EGFP-S和pLQa-pgsA’-EGFP，评价asd-alr标记的质粒与erm标记质粒的稳定性，结果显示asd-alr标记的质粒传代稳定性优于erm标记质粒，在选择性培养基上传100代后质粒无丢失。为构建共锚定表达质粒，先以pLQa-pgsA’为基础构建锚定表达红色荧光蛋白(mCherry)质粒pLQa-pgsA’-mCherry，再以pLQa-EGFP-S和pLQa-pgsA’-mCherry为框架，采用PCR技术将pgsA’-mCherry和EGFP-S两种锚定表达框的上游分别引入核糖体结合位点序列(Shine-Dalgarno sequence, SD)，PCR产物纯化后分别克隆到线性化载体pLQa-EGFP-S/HindⅢ和pLQa-pgsA’-mCherry/HindⅢ，构建共锚定表达质粒pLQa-ES-p’m和pLQa-p’m-ES，经Westernblot检测蛋白表达，EGFP在质粒pLQa-ES-p’m表达量显著低于pLQa-EGFP-S(P＜0.05)，极显著高于pLQa-p’m-ES(P＜0.01)，mCherry在质粒pLQa-ES-p’m表达的量与pLQa-pgsA’-mCherry和pLQa-p’m-ES相比差异均不显著(P＞0.05)。结果表明质粒pLQa-ES-p’m共锚定表达外源蛋白能力优于pLQa-p’m-ES，免疫荧光和流式细胞术进一步证实此项结果。
(3)共锚定表达SO7和EtMIC2植物乳杆菌免疫保护效果评价
利用asd-alr标记的无抗锚定表达载体，分别构建了单锚定表达SO7和EtMIC2抗原的植物乳杆菌Lp/SO7和Lp/EtMIC2，共锚定表达SO7和EtMIC2抗原的植物乳杆菌Lp/pLQa-EtMIC2-S-p’SO7(Lp/27)，评价各疫苗菌株的抗球虫效果。雏鸡随机分成8组，分别为PBS组、PBS-challenge组、空载体Lp/pgsA’组、Lp/SO7组、Lp/EtMIC2组、Lp/27组、Mixture组(Lp/SO7和Lp/EtMIC2菌株1:1混合)和疫苗组(Vaccine)，在4~6日龄、18~20日龄实验组每羽口服100μL2×109CFU的乳酸菌，PBS和PBS-challenge组口服100μLPBS，Vaccine拌料经口于4日龄免疫一次。加强免疫后10天，对血清IgY、肠道分泌型抗体(SIgA)抗体及细胞因子检测；分离外周血及脾脏淋巴细胞用于CD4+T和CD8+T淋巴细胞亚型、Bu1+B细胞的含量测定及淋巴细胞增殖试验。在30日龄时，感染5×104个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊后，测量体重，卵囊计数，观察盲肠，制备病理切片。
结果表明Lp/27组和Mixture组能有效提高外周血及脾脏中CD3+CD8+T、CD3+CD8+T及Bu1+B的含量，促进抗原特异性CD8+T和CD4+T细胞增殖，增加血清中细胞因子IL-2、IL-4和INF-γ水平，促进血清特异性IgY和黏膜SIgA分泌。感染球虫后，Lp/27组或Mixture组雏鸡的平均增重均显著高于Lp/pgsA’(P＜0.001)及单抗原组Lp/SO7(P＜0.05)和Lp/EtMIC2组(P＜0.001)，与Vaccine组差异不显著(P＞0.05)；球虫感染后Lp/SO7、Lp/EtMIC2、Lp/27、Mixture和Vaccine组均能较少卵囊排出，其中Lp/27和Mixture平均排出卵囊数分别为0.363×106和0.350×106个；Lp/27组和Mixture组盲肠病变显著降低，平均计分分别为2.33和2.55；最后统计出Lp/SO7、Lp/EtMIC2、Lp/27、Mixture和Vaccine组抗球虫指数(ACI)分别为146.42、140.87、163.97、164.81和165.18，其中Lp/27组和Mixture组具有良好的抗球虫效果，与球虫活疫苗效果相当。
(4)新功能型复合植物乳杆菌抗鸡球虫效果研究
为进一步提高共锚定表达抗原菌株Lp/27抗球虫效果，将鸡IL-4锚定表达在NC8/Δalr表面，获得菌株Lp/IL-4，将其作为免疫增强剂与Lp/27菌株混合后免疫雏鸡，评价抗球虫效果。雏鸡随机分6组，每组20羽，分别是PBS组、PBS-challenge组、Lp/pgsA’组、Lp/IL-4组、Lp/27组、Minture2组(Lp/IL-4与Lp/27菌液1:1混合)。在4~6日龄、18~20日龄实验组每羽口服2×109CFU/100μL的乳酸菌菌株，PBS和PBS-challenge组口服100μLPBS。在30日龄检测血清IgY及黏膜SIgA，对盲肠扁桃体T细胞及B细胞亚型鉴定，检测脾脏淋巴细抗原特异性刺激细胞因子及细胞增殖情况。柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊感染后，测量体重，卵囊计数，观察盲肠病变并计分。
结果表明，MixtureⅡ组比Lp/27组显著提高血清中抗SO7和EtMIC2特异性IgY及SIgA分泌(P＜0.05)；与PBS组相比MixtureⅡ组能显著增加盲肠扁桃体中CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞(P＜0.05)及B细胞的含量(P＜0.01)，与Lp/27组相比有升高趋势；MixtureⅡ与PBS组相比显著提高雏脾脏细胞中抗原特异性细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的表达，同时显著促进脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞的特异性增殖，与Lp/27组相比有升高趋势，差异不显著。球虫染后，MixtureⅡ组的平均增重最高，相对增重率为103.3%，与Lp/27组相比MixtureⅡ组显著降低卵囊排出(P<0.05)；与其他各组相比，MixtureⅡ盲肠病变最轻，计分为0.8；PBS-challenge组、Lp/pgsA’组、Lp/IL-4组、Lp/27组、Minture2组ACI值分别为97.30，116.60，145.78，175.18，190.03，Lp/IL-4有中等的抗球虫效果，Lp/27组良好，MixtureⅡ组效果最优。
本研究选用asd-alr基因为无抗性筛选标记，采用不同的锚定序列即S-anchoring和pgsA’，构建了无抗性筛选标记的单质粒共锚定表达载体系统，实现了两个荧光蛋白在植物乳杆菌表面共锚定表达，为后续多抗原定位表达研究奠定基础。体内实验表明，共锚定表达柔嫩艾美耳球虫SO7/EtMIC2抗原的植物乳杆菌，更能有效刺激机体免疫反应，抗球虫免疫保护效果优于单抗原表达菌株。同时以鸡IL-4为免疫佐剂，初步探究基因工程乳酸菌口服制剂抗球虫病机制，为开发新型抗球虫口服乳酸菌制剂提供平台。
(1)基于asd-alr基因无抗筛选表达载体受体系统NC8/Δalr/409ata构建
首先采用自杀质粒pNZ5319/pNZ5348将植物乳杆菌NC8基因组内的alr基因敲除，获得alr基因缺失株NC8/Δalr，代替野生型植物乳杆菌NC8作为alr标记载体的宿主菌；采用天冬氨酸-β半醛脱氢酶(asd)基因缺陷大肠杆菌(E.coliχ6212)作为无抗性标记质粒构建中间宿主菌，将诱导型大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pSIP409-pgsA’-IL-10的红霉素标记基因(erythromycin resistance gene， erm)用asd-alr基因替换，采用选择性培养，菌落PCR和Westernblots鉴定表明erm基因被替换，成功构建无抗筛选表达载体受体系NC8/Δalr/409ata。
(2)以asd-alr为非抗性筛选标记共锚定表达载体构建
以来源于嗜酸乳杆菌S-层蛋白的锚定序列S-anchoring和枯草芽孢杆菌膜蛋白锚定序列pgsA’为锚定表达框，分别构建以erm为筛选标记单锚定表达载体pLp-S和pLp-pgsA’，以asd-alr为筛选标记分别构建无抗标记锚定表达载体pLQa-S和pLQa-pgsA’。以EGFP为模式蛋白，构建erm标记锚定表达质粒pLp-EGFP-S和pLp-pgsA’-EGFP，以及asd-alr标记的锚定表达质粒pLQa-EGFP-S和pLQa-pgsA’-EGFP，评价asd-alr标记的质粒与erm标记质粒的稳定性，结果显示asd-alr标记的质粒传代稳定性优于erm标记质粒，在选择性培养基上传100代后质粒无丢失。为构建共锚定表达质粒，先以pLQa-pgsA’为基础构建锚定表达红色荧光蛋白(mCherry)质粒pLQa-pgsA’-mCherry，再以pLQa-EGFP-S和pLQa-pgsA’-mCherry为框架，采用PCR技术将pgsA’-mCherry和EGFP-S两种锚定表达框的上游分别引入核糖体结合位点序列(Shine-Dalgarno sequence, SD)，PCR产物纯化后分别克隆到线性化载体pLQa-EGFP-S/HindⅢ和pLQa-pgsA’-mCherry/HindⅢ，构建共锚定表达质粒pLQa-ES-p’m和pLQa-p’m-ES，经Westernblot检测蛋白表达，EGFP在质粒pLQa-ES-p’m表达量显著低于pLQa-EGFP-S(P＜0.05)，极显著高于pLQa-p’m-ES(P＜0.01)，mCherry在质粒pLQa-ES-p’m表达的量与pLQa-pgsA’-mCherry和pLQa-p’m-ES相比差异均不显著(P＞0.05)。结果表明质粒pLQa-ES-p’m共锚定表达外源蛋白能力优于pLQa-p’m-ES，免疫荧光和流式细胞术进一步证实此项结果。
(3)共锚定表达SO7和EtMIC2植物乳杆菌免疫保护效果评价
利用asd-alr标记的无抗锚定表达载体，分别构建了单锚定表达SO7和EtMIC2抗原的植物乳杆菌Lp/SO7和Lp/EtMIC2，共锚定表达SO7和EtMIC2抗原的植物乳杆菌Lp/pLQa-EtMIC2-S-p’SO7(Lp/27)，评价各疫苗菌株的抗球虫效果。雏鸡随机分成8组，分别为PBS组、PBS-challenge组、空载体Lp/pgsA’组、Lp/SO7组、Lp/EtMIC2组、Lp/27组、Mixture组(Lp/SO7和Lp/EtMIC2菌株1:1混合)和疫苗组(Vaccine)，在4~6日龄、18~20日龄实验组每羽口服100μL2×109CFU的乳酸菌，PBS和PBS-challenge组口服100μLPBS，Vaccine拌料经口于4日龄免疫一次。加强免疫后10天，对血清IgY、肠道分泌型抗体(SIgA)抗体及细胞因子检测；分离外周血及脾脏淋巴细胞用于CD4+T和CD8+T淋巴细胞亚型、Bu1+B细胞的含量测定及淋巴细胞增殖试验。在30日龄时，感染5×104个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊后，测量体重，卵囊计数，观察盲肠，制备病理切片。
结果表明Lp/27组和Mixture组能有效提高外周血及脾脏中CD3+CD8+T、CD3+CD8+T及Bu1+B的含量，促进抗原特异性CD8+T和CD4+T细胞增殖，增加血清中细胞因子IL-2、IL-4和INF-γ水平，促进血清特异性IgY和黏膜SIgA分泌。感染球虫后，Lp/27组或Mixture组雏鸡的平均增重均显著高于Lp/pgsA’(P＜0.001)及单抗原组Lp/SO7(P＜0.05)和Lp/EtMIC2组(P＜0.001)，与Vaccine组差异不显著(P＞0.05)；球虫感染后Lp/SO7、Lp/EtMIC2、Lp/27、Mixture和Vaccine组均能较少卵囊排出，其中Lp/27和Mixture平均排出卵囊数分别为0.363×106和0.350×106个；Lp/27组和Mixture组盲肠病变显著降低，平均计分分别为2.33和2.55；最后统计出Lp/SO7、Lp/EtMIC2、Lp/27、Mixture和Vaccine组抗球虫指数(ACI)分别为146.42、140.87、163.97、164.81和165.18，其中Lp/27组和Mixture组具有良好的抗球虫效果，与球虫活疫苗效果相当。
(4)新功能型复合植物乳杆菌抗鸡球虫效果研究
为进一步提高共锚定表达抗原菌株Lp/27抗球虫效果，将鸡IL-4锚定表达在NC8/Δalr表面，获得菌株Lp/IL-4，将其作为免疫增强剂与Lp/27菌株混合后免疫雏鸡，评价抗球虫效果。雏鸡随机分6组，每组20羽，分别是PBS组、PBS-challenge组、Lp/pgsA’组、Lp/IL-4组、Lp/27组、Minture2组(Lp/IL-4与Lp/27菌液1:1混合)。在4~6日龄、18~20日龄实验组每羽口服2×109CFU/100μL的乳酸菌菌株，PBS和PBS-challenge组口服100μLPBS。在30日龄检测血清IgY及黏膜SIgA，对盲肠扁桃体T细胞及B细胞亚型鉴定，检测脾脏淋巴细抗原特异性刺激细胞因子及细胞增殖情况。柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊感染后，测量体重，卵囊计数，观察盲肠病变并计分。
结果表明，MixtureⅡ组比Lp/27组显著提高血清中抗SO7和EtMIC2特异性IgY及SIgA分泌(P＜0.05)；与PBS组相比MixtureⅡ组能显著增加盲肠扁桃体中CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞(P＜0.05)及B细胞的含量(P＜0.01)，与Lp/27组相比有升高趋势；MixtureⅡ与PBS组相比显著提高雏脾脏细胞中抗原特异性细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的表达，同时显著促进脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞的特异性增殖，与Lp/27组相比有升高趋势，差异不显著。球虫染后，MixtureⅡ组的平均增重最高，相对增重率为103.3%，与Lp/27组相比MixtureⅡ组显著降低卵囊排出(P<0.05)；与其他各组相比，MixtureⅡ盲肠病变最轻，计分为0.8；PBS-challenge组、Lp/pgsA’组、Lp/IL-4组、Lp/27组、Minture2组ACI值分别为97.30，116.60，145.78，175.18，190.03，Lp/IL-4有中等的抗球虫效果，Lp/27组良好，MixtureⅡ组效果最优。
本研究选用asd-alr基因为无抗性筛选标记，采用不同的锚定序列即S-anchoring和pgsA’，构建了无抗性筛选标记的单质粒共锚定表达载体系统，实现了两个荧光蛋白在植物乳杆菌表面共锚定表达，为后续多抗原定位表达研究奠定基础。体内实验表明，共锚定表达柔嫩艾美耳球虫SO7/EtMIC2抗原的植物乳杆菌，更能有效刺激机体免疫反应，抗球虫免疫保护效果优于单抗原表达菌株。同时以鸡IL-4为免疫佐剂，初步探究基因工程乳酸菌口服制剂抗球虫病机制，为开发新型抗球虫口服乳酸菌制剂提供平台。