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番鸭呼肠孤病毒感染（Muscovy duck reovirus infection）可引起雏番鸭、半番鸭的免疫抑制性传染病，对消化道和呼吸道损害最为严重。该传染病的病原为番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV），本实验室对病毒与宿主细胞的相互作用的研究发现MDRV感染可诱导细胞自噬，但其具体的作用及其机制尚未明了。本研究主要针对MDRV与细胞自噬的相互作用进行了深入探讨，分析了MDRV调控细胞自噬过程以及对病毒本身产生的影响。主要研究内容包括：
1．MDRV感染诱导DF-1细胞产生自噬现象
应用透射电子显微技术、免疫荧光显微镜技术以及Western Blot免疫印迹三种不同的方法，来检测MDRV感染前后的DF-1细胞中的自噬水平。通过透射电子显微镜可以观察到被MDRV感染的细胞中出现了典型的双层膜自噬样结构；与未感染的细胞中弥散分布的LC3蛋白相比，感染MDRV的细胞内LC3呈明显点状聚集分布；Western Blot检测到感染组LC3Ⅱ的表达水平比空白组明显升高，且随着病毒复制不断增加。以上结果表明，MDRV感染可以诱导DF-1细胞产生自噬，并且提示自噬水平与病毒复制呈正相关。
2．MDRV通过抑制自噬-溶酶体降解途径促进病毒复制
(1)通过先用自噬药物调节剂作用DF-1细胞再感染MDRV的方法，检测分析病毒结构蛋白的表达水平以及病毒的TCID50。结果表明，利用自噬诱导剂Rapamycin提高DF-1细胞自噬水平后，病毒结构蛋白σA的水平出现显著提高，病毒的TCID50也明显上升；当细胞自噬水平被自噬抑制剂3-MA调节降低后，DF-1细胞内σA蛋白的表达量以及相应的病毒滴度也出现明显下降。表明MDRV诱导的细胞自噬可以促进病毒在DF-1细胞内复制。
(2)确定细胞自噬与病毒复制关系的基础上，进一步研究了MDRV引起的自噬体与病毒之间的关系。通过荧光免疫技术发现在MDRV的结构蛋白σA和病毒复制过程中起到重要作用的非结构蛋白σNS都能够与自噬体标志分子LC3-Ⅱ发生共定位，进一步说明自噬体结构为MDRV复制提供了膜支持。
(3)试验选用了相关自噬体与溶酶体降解阻断剂来进行研究自噬过程与病毒复制的相互影响。结果显示阻断了自噬体和溶酶体的正常融合能够抑制MDRV的复制。通过转染双荧光质粒mcherry-EGFP-LC3发现，与空白组相比，MDRV感染后自噬体更容易与酸性囊泡融合，并且MDRV感染的细胞中能够观察到pEGFP-LC3B荧光呈现点状聚集，与LAMP1共定位之后出现红色与绿色重合的黄色荧光，这表示MDRV感染会促进自噬体与溶酶体系统的融合。但与此同时，Western Blot分析发现细胞内源性的p62并没有呈现正常的下降趋势，以上结果表明最终形成的自噬溶酶体并没有进行有效的降解。
(4)试验通过Western Blot分析溶酶体的相关蛋白，进一步研究MDRV阻断自噬溶酶体降解过程的具体机制。结果发现MDRV感染后的细胞中LAMP1的表达量会出现异常积累。晚期内体可与含有溶酶体酶的转运小泡融合成还未开始执行降解功能的早期溶酶体，作为晚期内体/早期溶酶体标志蛋白的LAMP1表达量增加，提示非成熟溶酶体数量的增多。
(5)试验检测了细胞中溶酶体酸性水解酶Cathepsin D的成熟情况，进一步确认MDRV对溶酶体成熟的影响。Cathepsin D需要经历系列的表达后修饰才能形成33KDa大小的成熟Cathepsin D。通过免疫印迹技术发现MDRV感染后33kDa大小的的成熟形式的Cathepsin D的表达量明显减少，说明MDRV抑制溶酶体的成熟。
综上所述，番鸭呼肠孤病毒诱导感染DF-1细胞的自噬，促进自噬体与溶酶体的融合并抑制自噬溶酶体的降解，促进病毒的复制。
1．MDRV感染诱导DF-1细胞产生自噬现象
应用透射电子显微技术、免疫荧光显微镜技术以及Western Blot免疫印迹三种不同的方法，来检测MDRV感染前后的DF-1细胞中的自噬水平。通过透射电子显微镜可以观察到被MDRV感染的细胞中出现了典型的双层膜自噬样结构；与未感染的细胞中弥散分布的LC3蛋白相比，感染MDRV的细胞内LC3呈明显点状聚集分布；Western Blot检测到感染组LC3Ⅱ的表达水平比空白组明显升高，且随着病毒复制不断增加。以上结果表明，MDRV感染可以诱导DF-1细胞产生自噬，并且提示自噬水平与病毒复制呈正相关。
2．MDRV通过抑制自噬-溶酶体降解途径促进病毒复制
(1)通过先用自噬药物调节剂作用DF-1细胞再感染MDRV的方法，检测分析病毒结构蛋白的表达水平以及病毒的TCID50。结果表明，利用自噬诱导剂Rapamycin提高DF-1细胞自噬水平后，病毒结构蛋白σA的水平出现显著提高，病毒的TCID50也明显上升；当细胞自噬水平被自噬抑制剂3-MA调节降低后，DF-1细胞内σA蛋白的表达量以及相应的病毒滴度也出现明显下降。表明MDRV诱导的细胞自噬可以促进病毒在DF-1细胞内复制。
(2)确定细胞自噬与病毒复制关系的基础上，进一步研究了MDRV引起的自噬体与病毒之间的关系。通过荧光免疫技术发现在MDRV的结构蛋白σA和病毒复制过程中起到重要作用的非结构蛋白σNS都能够与自噬体标志分子LC3-Ⅱ发生共定位，进一步说明自噬体结构为MDRV复制提供了膜支持。
(3)试验选用了相关自噬体与溶酶体降解阻断剂来进行研究自噬过程与病毒复制的相互影响。结果显示阻断了自噬体和溶酶体的正常融合能够抑制MDRV的复制。通过转染双荧光质粒mcherry-EGFP-LC3发现，与空白组相比，MDRV感染后自噬体更容易与酸性囊泡融合，并且MDRV感染的细胞中能够观察到pEGFP-LC3B荧光呈现点状聚集，与LAMP1共定位之后出现红色与绿色重合的黄色荧光，这表示MDRV感染会促进自噬体与溶酶体系统的融合。但与此同时，Western Blot分析发现细胞内源性的p62并没有呈现正常的下降趋势，以上结果表明最终形成的自噬溶酶体并没有进行有效的降解。
(4)试验通过Western Blot分析溶酶体的相关蛋白，进一步研究MDRV阻断自噬溶酶体降解过程的具体机制。结果发现MDRV感染后的细胞中LAMP1的表达量会出现异常积累。晚期内体可与含有溶酶体酶的转运小泡融合成还未开始执行降解功能的早期溶酶体，作为晚期内体/早期溶酶体标志蛋白的LAMP1表达量增加，提示非成熟溶酶体数量的增多。
(5)试验检测了细胞中溶酶体酸性水解酶Cathepsin D的成熟情况，进一步确认MDRV对溶酶体成熟的影响。Cathepsin D需要经历系列的表达后修饰才能形成33KDa大小的成熟Cathepsin D。通过免疫印迹技术发现MDRV感染后33kDa大小的的成熟形式的Cathepsin D的表达量明显减少，说明MDRV抑制溶酶体的成熟。
综上所述，番鸭呼肠孤病毒诱导感染DF-1细胞的自噬，促进自噬体与溶酶体的融合并抑制自噬溶酶体的降解，促进病毒的复制。