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新城疫病毒（Newcastle disease viruses,NDV）是危害家禽业的重要病原之一，可引起鸽发生新城疫（Newcastle disease,ND），也称鸽Ⅰ型副黏病毒（Pigeon paramyxovirus type1,PPMV-1）病。近十年，该病常在我国肉鸽群发生和流行，给养鸽业造成巨大的经济损失。为了探究广西鸽新城疫的流行情况及不同基因型NDV对鸽的致病性和NDV感染鸽的转录组学的差异，本研究进行了鸽NDV流行毒株的分离鉴定，并用三株不同基因型NDV毒株进行鸽的致病性试验及感染鸽的转录组测序并验证。主要研究内容和结果如下：
1、本研究采集最近冬季发生的鸽新城疫病例临床样品，进行样品检测和NDV的分离鉴定，结果分离到一株鸽源NDV毒株，命名为Pi/CH/GX1220/2019株。对分离株的F基因进行克隆和基因序列分析，结果表明，分离株F蛋白裂解位点氨基酸基序为112RRQKRF117，符合NDV强毒株裂解位点的特征；Pi/CH/GX1220/2019属于基因Ⅵ.2.1.1.2.1（Ⅵj）NDV；遗传进化分析发现该分离株与近年广西地区流行的PPMV-1毒株亲缘关系较近；分子钟结果表明本分离株可能来源于广东。
2、基因Ⅵ型NDV为感染宿主鸽的优势基因型，基因Ⅶ型NDV仍是我国鸡群中主要流行株，基因Ⅷ型NDV在近10年再次在国内分离到，但目前尚未见基因Ⅷ型NDV对鸽的致病性研究。为了探索这三个不同基因型的NDV毒株对宿主鸽的致病性强弱，本研究使用基因Ⅵ型鸽源pi/CH/GXP22/2000株、基因Ⅶ型鸽源pi/CH/GXP40/2001株和基因Ⅷ型斗鸡源game-fowl/CH/GXGB2011/2011株进行人工感染鸽试验，结果表明，感染后三个感染组均出现发病，发病鸽组织病理学结果表现脾脏出血坏死、胰腺和盲肠扁桃体炎性细胞浸润、坏死。三个毒株感染鸽子后第3天和7天的鸽脾脏均能检测到病毒载量；pi/CH/GXP22/2000感染组的发病症状和病理变化最轻，无死亡，脾脏组织病毒载量也较低；而pi/CH/GXP40/2001感染组发病症状和病变最严重。结果表明，这三株NDV对鸽的致病性存在差异。
3、目前，由于不同基因型NDV感染鸽的转录组学比较研究较少，更缺乏基因Ⅷ型感染鸽的转录组分析资料。因此，本研究利用RNA-Seq技术对上述三株不同基因型NDV感染鸽在感染0天、感染后3天和7天的脾脏组织进行转录组分析。结果发现，与同一日龄对照组相比，三个感染组脾组织在7dpi富集到的差异基因均比3dpi多。三个病毒感染组引起差异显著上调的基因主要有炎症反应因子IL1B、IL18、SOCS1等；白介素家族相关基因如IL1R2、IL22R2、I17EL、IL7RA、IL2RA等；干扰素及其诱导的相关蛋白基因如IFI6、IFIT5、MX、ISG15、OASL等；趋化因子CCL3、CCL19、CCL21等；以及其他免疫应答、细胞凋亡相关基因如RIG-I、TLR22、BIRC1、RSAD2、β防御素7等。下调表达的基因主要与代谢相关，如GLR、GLUL、PLA2G、PA21B、CBPB1等。GO富集分析发现大多数与分子功能有关，KEGG通路分析发现NDV感染鸽子脾脏差异基因主要参与代谢相关途径和免疫应答反应。NDV感染鸽子脾脏差异基因主要参与代谢相关途径和免疫应答反应。基因Ⅵ型NDV最早激活鸽免疫应答，而基因Ⅶ型和基因Ⅷ型NDV激活鸽免疫应答虽然较晚，但是应答比基因Ⅵ型NDV强。本研究还成功建立了鸽RIG-I样信号通路和细胞凋亡通路相关因子的实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括鸽子RIG-I、TRIM25、MITA、IKK?、IκBα、Apaf1、BIRC2和GADD45B8个基因。该方法验证转录组学结果，两者趋势基本一致。
综上所述，本研究分离鉴定了一株基因Ⅵ.2.1.1.2.1（Ⅵj）亚型鸽源NDV，分析了该毒株遗传进化关系及来源。对三株不同基因型NDV毒株pi/CH/GXP22/2000、pi/CH/GXP40/2001和game-fowl/CH/GXGB2011/2011感染鸽进行致病性比较研究，发现pi/CH/GXP40/2001的致病性最强。对NDV感染鸽脾脏的转录组学分析获得了主要差异基因，这些病毒感染相关的差异基因主要参与代谢相关途径和免疫应答反应。为探索NDV分子流行病学研究、致病机理和免疫应答提供资料，并为NDV的防控提供参考依据。
1、本研究采集最近冬季发生的鸽新城疫病例临床样品，进行样品检测和NDV的分离鉴定，结果分离到一株鸽源NDV毒株，命名为Pi/CH/GX1220/2019株。对分离株的F基因进行克隆和基因序列分析，结果表明，分离株F蛋白裂解位点氨基酸基序为112RRQKRF117，符合NDV强毒株裂解位点的特征；Pi/CH/GX1220/2019属于基因Ⅵ.2.1.1.2.1（Ⅵj）NDV；遗传进化分析发现该分离株与近年广西地区流行的PPMV-1毒株亲缘关系较近；分子钟结果表明本分离株可能来源于广东。
2、基因Ⅵ型NDV为感染宿主鸽的优势基因型，基因Ⅶ型NDV仍是我国鸡群中主要流行株，基因Ⅷ型NDV在近10年再次在国内分离到，但目前尚未见基因Ⅷ型NDV对鸽的致病性研究。为了探索这三个不同基因型的NDV毒株对宿主鸽的致病性强弱，本研究使用基因Ⅵ型鸽源pi/CH/GXP22/2000株、基因Ⅶ型鸽源pi/CH/GXP40/2001株和基因Ⅷ型斗鸡源game-fowl/CH/GXGB2011/2011株进行人工感染鸽试验，结果表明，感染后三个感染组均出现发病，发病鸽组织病理学结果表现脾脏出血坏死、胰腺和盲肠扁桃体炎性细胞浸润、坏死。三个毒株感染鸽子后第3天和7天的鸽脾脏均能检测到病毒载量；pi/CH/GXP22/2000感染组的发病症状和病理变化最轻，无死亡，脾脏组织病毒载量也较低；而pi/CH/GXP40/2001感染组发病症状和病变最严重。结果表明，这三株NDV对鸽的致病性存在差异。
3、目前，由于不同基因型NDV感染鸽的转录组学比较研究较少，更缺乏基因Ⅷ型感染鸽的转录组分析资料。因此，本研究利用RNA-Seq技术对上述三株不同基因型NDV感染鸽在感染0天、感染后3天和7天的脾脏组织进行转录组分析。结果发现，与同一日龄对照组相比，三个感染组脾组织在7dpi富集到的差异基因均比3dpi多。三个病毒感染组引起差异显著上调的基因主要有炎症反应因子IL1B、IL18、SOCS1等；白介素家族相关基因如IL1R2、IL22R2、I17EL、IL7RA、IL2RA等；干扰素及其诱导的相关蛋白基因如IFI6、IFIT5、MX、ISG15、OASL等；趋化因子CCL3、CCL19、CCL21等；以及其他免疫应答、细胞凋亡相关基因如RIG-I、TLR22、BIRC1、RSAD2、β防御素7等。下调表达的基因主要与代谢相关，如GLR、GLUL、PLA2G、PA21B、CBPB1等。GO富集分析发现大多数与分子功能有关，KEGG通路分析发现NDV感染鸽子脾脏差异基因主要参与代谢相关途径和免疫应答反应。NDV感染鸽子脾脏差异基因主要参与代谢相关途径和免疫应答反应。基因Ⅵ型NDV最早激活鸽免疫应答，而基因Ⅶ型和基因Ⅷ型NDV激活鸽免疫应答虽然较晚，但是应答比基因Ⅵ型NDV强。本研究还成功建立了鸽RIG-I样信号通路和细胞凋亡通路相关因子的实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括鸽子RIG-I、TRIM25、MITA、IKK?、IκBα、Apaf1、BIRC2和GADD45B8个基因。该方法验证转录组学结果，两者趋势基本一致。
综上所述，本研究分离鉴定了一株基因Ⅵ.2.1.1.2.1（Ⅵj）亚型鸽源NDV，分析了该毒株遗传进化关系及来源。对三株不同基因型NDV毒株pi/CH/GXP22/2000、pi/CH/GXP40/2001和game-fowl/CH/GXGB2011/2011感染鸽进行致病性比较研究，发现pi/CH/GXP40/2001的致病性最强。对NDV感染鸽脾脏的转录组学分析获得了主要差异基因，这些病毒感染相关的差异基因主要参与代谢相关途径和免疫应答反应。为探索NDV分子流行病学研究、致病机理和免疫应答提供资料，并为NDV的防控提供参考依据。