【摘 要】
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以肌动蛋白为基础的指状细胞突起,包括微绒毛、丝状伪足、静纤毛等,在许多细胞生理活动中发挥重要功能。目前已鉴定出很多参与调控细胞突起形成的蛋白,为我们理解细胞突起形成机制提供重要参考。FCHSD2属于FCH与Bin-Amphiphysin-Rvs（F-BAR）家族一员,它包含N端的一个F-BAR结构域、中间的两个SH3结构域和C端的PDZ结合结构域（PB1）。之前的研究表明FCHSD2在体外结合WA
【基金项目】
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国家自然科学基金（81771001和31070969）； 国家重点基础项目（2018YFC1003600）； 山东省自然科学基础研究项目（ZR2020ZD39）； 山东大学基础研究基金（2018JC025）；
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以肌动蛋白为基础的指状细胞突起,包括微绒毛、丝状伪足、静纤毛等,在许多细胞生理活动中发挥重要功能。目前已鉴定出很多参与调控细胞突起形成的蛋白,为我们理解细胞突起形成机制提供重要参考。FCHSD2属于FCH与Bin-Amphiphysin-Rvs（F-BAR）家族一员,它包含N端的一个F-BAR结构域、中间的两个SH3结构域和C端的PDZ结合结构域（PB1）。之前的研究表明FCHSD2在体外结合WASP/N-WASP而促进由ARP2/3介导的肌动蛋白聚合,而且FCHSD2在小鼠耳蜗毛细胞上表面高度特化的细胞突起即静纤毛上定位。这都提示我们FCHSD2可能在细胞突起的形成与维持方面发挥一定作用。本论文的数据表明FCHSD2的F-BAR结构域单独就可以引起细胞形成上表面突起（apical cell protrusions）和侧面细胞突起（lateral cell protrusions）两种细胞突起,而全长FCHSD2蛋白由于内部存在F-BAR与SH3结构域之间的相互作用而导致其形成闭合的失活构象,使之出现自抑制现象,而不能引起细胞突起。FCHSD2通过第一个SH3结构域介导与N-WASP的相互作用,能够部分解除FCHSD2自抑制并促进细胞形成上表面突起,而不影响细胞侧面突起的形成。生化实验结果表明FCHSD2、CDC42能够同时与N-WASP结合形成一个三元复合体,进而协同促进培养细胞上表面突起的形成。进一步研究表明FCHSD2调控细胞突起的形成依赖于其F-ABR结构域与质膜结合的能力。耳蜗毛细胞静纤毛作为一类由肌动蛋白装配成的高度特化的细胞表面突起,本质上可被看做是一种特化的微绒毛,它的发育与维持受到严格调控。FCHSD2调控肌动蛋白聚合和细胞突起形成以及其在小鼠静纤毛上的定位,让我们推测其在耳蜗毛细胞静纤毛发育或维持中可能发挥一定功能。我们检测并分析了Fchsd2敲除小鼠的表型,发现FCHSD2的缺失没有影响小鼠静纤毛的发育,而是造成小鼠外毛细胞静纤毛维持的异常。Fchsd2敲除小鼠底回外毛细胞在2月龄开始出现第三排静纤毛的退化,3月龄顶、中、底回外毛细胞静纤毛第三排退化现象加剧,直至整个外毛细胞静纤毛束退化消失,最终导致毛细胞死亡,敲除小鼠出现渐进性听力损失。同时,Fchsd2敲除小鼠对噪声刺激更加敏感,敲除小鼠外毛细胞静纤毛更易受到噪声刺激而退化,导致小鼠出现永久性听力损失。为了探索CDC42是否参与了 FCHSD2调控小鼠静纤毛维持的过程,我们构建了Atoh1-Cre+/-;Cdc42Loxp/Loxp;Fch.sd2-/-双敲小鼠并对其听力水平及毛细胞静纤毛形态进行检测。结果表明单一基因敲除背景下另一基因单拷贝缺失小鼠表现出较单一基因敲除小鼠更严重的听力损失和毛细胞静纤毛的紊乱与退化。双敲小鼠表现表现出最严重的听力损失和毛细胞静纤毛的紊乱与退化。CDC42与FCHSD2协同调控毛细胞静纤毛的维持,但具体的调控机制尚不清楚。因此,我们需要对Fchsd2-/-敲除小鼠进行更深入的研究,以阐明FCHSD2在静纤毛维持方面的具体分子机制。本论文创新点及意义:本课题通过COS-7细胞中转染FCHSD2、CDC42、N-WASP各截短或全长表达载体,在细胞水平探讨了 FCHSD2调控细胞突起形成的方式与可能的分子机制。同时,我们利用Fchsd2敲除小鼠,在动物生理水平研究了 FCHSD2敲除对小鼠内耳毛细胞静纤毛发育或维持中的影响。我们还利用Cdc42/Fchsd2双敲小鼠分析FCHSD2在维持小鼠静纤毛这一高度特化的毛细胞表面突起过程中是否有CDC42的参与。本课题的创新性及意义主要有以下几点:1.本文揭示了 FCHSD2能够以不同方式引起两种类型的细胞表面突起:细胞上表面突起和侧面细胞突起,这对我们深入了解F-BAR蛋白功能提供了重要参考。2.验证了 FCHSD2内部存在F-BAR结构域与SH3结构域的相互作用,导致全长FCHSD2出现自抑制现象。3.证明了 FCHSD2能够与CDC42、N-WASP形成三元复合体,协同促进细胞上表面突起的形成,对细胞突起形成的机制提供了新的信息。4.我们利用Fchsd2敲除小鼠,研究了 FCHSD2敲除对小鼠内耳毛细胞静纤毛发育或维持的影响。目前的数据表明FCHSD2的缺失对小鼠静纤毛的发育没有明显影响,但会造成外毛细胞静纤毛维持异常。Fchsd2敲除小鼠表现出渐进性听力损失,而且对噪声刺激更加敏感。目前为止在动物水平对FCHSD2功能的研究较少,本文为FCHSD2的在体功能研究提供了一些新发现。5.对Cdc42/Fchsd2双敲小鼠更精细的静纤毛表型分析发现,双敲小鼠表现出更严重的静纤毛的紊乱、缺失,毛细胞的死亡,最终导致听力损失。CDC42与FCHSD2协同调控了毛细胞静纤毛的维持。
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