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研究背景子宫内膜癌（Endometrial Carcinoma,EC）是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,为女性生殖道三大恶性肿瘤之一,占女性全身恶性肿瘤的7%,占女性生殖道恶性肿瘤的20%-30%。近年来,EC在全球范围内发病率和死亡率呈上升趋势,且患者趋于年轻化,严重威胁女性的健康。尽管早期EC患者获得了良好的5年生存率（95%）,但是转移性EC患者的5年生存率下降到16%,同样复发或局部晚期EC患者的预后也很差,5年的生存率下降到17%。随着现代医学的发展,早期诊断、手术、放疗和化疗可以显著改善治疗效果,但对早期保留生育能力的患者及晚期复发性EC仍没有有效的治疗方法。肿瘤分期、分级、组织学亚型、深肌层浸润和淋巴脉管受累已被确定为EC的主要预后因素,近年来EC的分子分型也对预后有较高的预测价值。目前,EC没有可靠的早期诊断的方法,因此,寻找新的生物标志物,探寻EC发生、发展及预后的潜在分子机制,早期诊断EC及确定潜在的治疗靶点至关重要。细胞分裂是正常组织生长发育所必需的生物学过程。然而,异常的细胞分裂可能导致不受控制的细胞增殖和参与癌症等疾病的发生。细胞分裂周期相关基因8（Cell division cycle associated gene 8,CDCA8）,又称 Borealin/Dasra B,是染色体乘客复合体（chromosomal passenger complex,CPC）家族成员之一,该复合体是有丝分裂和细胞分裂的重要调节因子并受细胞周期调节。CDCA8在定位CPC到着丝粒、纠正动粒结合错误、稳定双极纺锤体等方面发挥重要作用。对CDCA8基因的表达分析结果显示,其在肿瘤细胞和未分化的人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）中高表达,在正常细胞中无表达或有微弱表达。在乳腺癌细胞中,敲除CDCA8基因可抑制细胞生长并出现细胞周期G1期阻滞,伴随凋亡相关分子的增加,CDCA8基因在细胞生长、分化、肿瘤进展和凋亡等体外细胞过程中发挥重要调节作用。也有研究表明,CDCA8基因的过表达与肿瘤的生长、进展和不良预后有关。但在EC中,CDCA8基因的表达情况、生物学行为及其机制尚未被报道。综上,本研究利用生物信息学技术、子宫内膜癌组织、子宫内膜癌细胞系及裸鼠模型,通过多种手段研究CDCA8基因在EC中的表达及与临床病理及预后的关系,研究CDCA8基因在子宫内膜癌细胞中的生物学功能,进一步探讨CDCA8基因在EC发生发展中的作用机制及可否作为新的生物标记物及治疗靶点提供线索和思路。第一部分CDCA8基因在子宫内膜癌中的表达及与临床病理预后的关系研究目的对比分析子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中CDCA8基因表达水平的差异情况,分析其表达差异和子宫内膜癌分期、分级、组织学类型、肌层浸润、淋巴转移、远处转移及预后的关系。具体分析CDCA8基因表达变化与临床病理特征及预后的关系。研究方法1.通过对公共测序信息数据库癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）、基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）和临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium,CPTAC）数据库进行数据挖掘,研究CDCA8基因在子宫内膜癌及正常子宫内膜组织中的表达差异情况,并分析CDCA8基因表达量与子宫内膜癌临床病理特征及预后的关系。2.对54例子宫内膜癌及28例正常子宫内膜组织石蜡切片行免疫组化染色,探讨CDCA8蛋白水平的表达量,比较CDCA8在子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中的表达量差异。探讨CDCA8表达量与子宫内膜癌分期、病理分级、组织学分型、肌层浸润、远处转移、淋巴转移的关系。研究结果1.TCGA数据库分析证实CDCA8基因在子宫内膜癌中的表达量显著高于正常子宫内膜组织（P＜0.01）。GEO数据库及CPTAC数据库分析进一步证实CDCA8基因的表达在子宫内膜癌中显著高于正常子宫内膜组织（p＜0.01）。2.TCGA数据库分析证实CDCA8基因高表达与更高的肿瘤分期（P＜0.01）、肿瘤分级（P＜0.01）、远处转移（P＜0.01）、淋巴结转移（P＜0.01）呈正相关;而与肿瘤组织学分型、腹水细胞学是否阳性及患者绝经状态之间没有相关性（P＞0.05）。3.TCGA数据库分析证实CDCA8基因高表达患者总生存期明显低于CDCA8基因低表达患者（P＜0.05）,单因素Cox回归分析显示CDCA8基因是子宫内膜癌的预后相关因素。但多因素Cox回归分析显示CDCA8基因不是子宫内膜癌预后的独立预测因子。4.54例子宫内膜癌组织及28例正常子宫内膜组织石蜡切片CDCA8免疫组化染色分析发现子宫内膜癌组织中CDCA8表达量显著高于正常子宫内膜组织（P＜0.01）。CDCA8高表达与更高的肿瘤分期（P＜0.01）、肿瘤分级（P＜0.01）、肌层浸润深度（P＜0.01）成正相关。非子宫内膜样癌中CDCA8表达量显著高于子宫内膜样癌（p＜0.01）。而CDCA8的表达与肿瘤远处转移及淋巴结转移之间无显著差异（P＞0.05）,原因可能与远处转移及淋巴转移的子宫内膜癌组织样本量偏少有关。结论CDCA8基因及其编码蛋白在子宫内膜癌组织中高表达,且其表达水平与子宫内膜癌的病理分期及肿瘤分级相关,CDCA8的高表达与不良临床病理特征及患者预后相关。因此,CDCA8基因是子宫内膜癌发生发展的关键基因,可能在肿瘤发生、发展和转移过程中起着重要的作用。第二部分 CDCA8基因在子宫内膜癌细胞系中的功能研究研究目的探究CDCA8基因敲减及过表达对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响,并通过动物实验检测敲减CDCA8基因对子宫内膜癌裸鼠皮下成瘤生长的影响。研究方法1.通过Western blot检测子宫内膜癌细胞系Ishikawa和KLE中CDCA8在蛋白水平的表达情况。2.设计并合成不同的针对CDCA8的si-RNA片段,并成功转染至Ishikawa和KLE细胞中,选择效果最佳的si-RNA片段敲减Ishikawa和KLE中CDCA8的表达。3.构建过表达CDCA8的质粒载体,成功转染Ishikawa和KLE细胞,特异性过表达Ishikawa 和 KLE 中 CDCA8。4.采用MTT实验和平板克隆实验检测敲减和过表达CDCA8基因对子宫内膜癌细胞系（Ishikawa、KLE）体外细胞增殖能力的影响。5.根据siRNA-CDCA8-623序列设计合成慢病毒shRNA-CDCA8,构建稳定敲减CDCA8基因的细胞株和阴性对照细胞株,建立裸鼠皮下成瘤模型,进一步验证CDCA8敲减在体内实验中对子宫内膜癌细胞增殖能力的影响。收集实验组与对照组子宫内膜癌裸鼠移植瘤组织制作病理切片,并行免疫组化,验证CDCA8基因在体内敲减效果。6.用划痕实验和Transwell实验检测敲减和过表达CDCA8基因对子宫内膜癌细胞系（Ishikawa、KLE）迁移、侵袭能力的影响。7.用流式细胞仪检测敲减和过表达CDCA8基因对子宫内膜癌细胞系（Ishikawa、KLE）细胞凋亡和细胞周期的影响。研究结果1.Western blot检测CDCA8在Ishikawa和KLE细胞系中均有表达。2.本研究共选择了 CDCA8的3个位点设计合成CDCA8-siRNA,并分别转染至Ishikawa和KLE中,通过qRT-PCR和Western blot验证了各组的敲减效果,证实si-RNA-623敲减效果最佳,敲减效率达到了 70%以上。3.成功构建过表达CDCA8的质粒载体（pl-CDCA8）,并成功转染Ishikawa和KLE细胞,qRT-PCR及Western blot验证其过表达效果,证实CDCA8过表达效果达到90%以上。4.MTT细胞增殖实验结果显示,与阴性对照组相比,siRNA敲减CDCA8基因导致子宫内膜癌细胞Ishikawa与KLE增殖能力显著减弱,而过表达CDCA8使细胞增殖能力显著增强,差异有统计学意义（P＜0.01）。平板克隆实验显示,与阴性对照组相比,敲减CDCA8后单克隆形成的个数明显少于对照组,过表达CDCA8后单克隆形成的个数明显多于对照组,且差异有统计学意义（P＜0.01）。5.构建shRNA-CDCA8稳转细胞株,利用荧光显微镜、qRT-PCR和Western blot验证用慢病毒转染Ishikawa和KLE细胞后,CDCA8表达水平达到有效敲减,其中Ishikawa细胞株的敲减效率更高。6.裸鼠成瘤实验结果显示CDCA8稳定敲减的Ishikawa细胞株成瘤后肿瘤生长能力明显弱于对照组细胞,在生长曲线、肿瘤体积和肿瘤重量上均有统计学差异（P＜0.01）。免疫组化结果显示,实验组肿瘤CDCA8染色强度明显低于对照组,进一步证实在体肿瘤中实验组CDCA8表达稳定被抑制。7.划痕实验中,敲减CDCA8基因后Ishikawa与KLE细胞的迁移能力较阴性对照组显著下降,过表达CDCA8基因后细胞迁移能力显著增强,差异有统计学意义（P＜0.01）。在Transwell细胞侵袭、迁移实验中,敲减CDCA8基因可显著抑制Ishikawa和KLE细胞的侵袭及迁移能力,过表达CDCA8基因可促进细胞的侵袭及迁移能力,差异有统计学意义（P＜0.01）。8.流式细胞术检测细胞凋亡结果显示,在Ishikawa与KLE细胞中,CDCA8敲减组细胞早期凋亡比例较对照组增多,凋亡相关分子c-myc及caspase3表达增加,抗凋亡相关分子bcl-2表达减少,差异有统计学意义（P＜0.01）。而CDCA8过表达组细胞早期凋亡比例较对照组减少,凋亡相关分子c-myc及caspase3表达减少,抗凋亡相关分子bcl-2表达增加,差异有统计学意义（P＜0.01）。9.流式细胞术检测细胞周期结果显示,与阴性对照组相比,敲减CDCA8基因导致Ishikawa及KLE细胞出现G2/M期阻滞（P＜0.05）,而上调CDCA8基因Ishikawa及KLE细胞中各细胞周期间无统计学差异（P＞0.05）。结论1.敲减CDCA8基因可抑制子宫内膜癌细胞系Ishikawa及KLE的增殖、侵袭、迁移能力,敲减CDCA8基因可促进细胞凋亡,导致细胞周期G2/M期阻滞。2.过表达CDCA8基因可促进子宫内膜癌细胞系Ishikawa及KLE的增殖、侵袭、迁移能力,过表达CDCA8基因可抑制细胞凋亡,不引起细胞周期阻滞。因此,CDCA8基因可能成为子宫内膜癌潜在的治疗靶点。第三部分CDCA8基因调控相关通路调节子宫内膜癌细胞机制研究研究目的探讨CDCA8基因在子宫内膜癌中的潜在作用机制,进一步验证CDCA8基因可能通过调节细胞周期,通过ERK/Akt、P53/Rb信号通路,参与促进子宫内膜癌发生及发展的机制。研究方法1.通过公共测序信息数据库TCGA进行数据挖掘,获取552例子宫内膜癌患者基因表达谱数据,通过GSEA（Gene set enrichment Analysis）技术预测CDCA8基因在子宫内膜癌中发挥作用的生物学过程及调控的信号转导通路。2.敲减和过表达Ishikawa和KLE中CDCA8基因的表达,应用Western blot方法检测细胞分裂周期蛋白CyclinD1、CyclinB1、CyclinA1的表达变化,检测细胞分裂周期蛋白激酶CDK6、CDC2的表达变化。3.敲减和过表达Ishikawa和KLE中CDCA8基因的表达,应用Western blot方法检测信号通路关键分子ERK/p-ERK、Akt/p-Akt、P53、Rb的表达变化。研究结果1.GSEA结果显示CDCA8基因功能主要与卵母细胞减数分裂、细胞周期、RNA聚合酶、同源重组、DNA复制、错配修复有关,而CDCA8基因参与子宫内膜癌发生及进展的过程与ERBB信号通路、P53信号通路、WNT信号通路、VEGF信号通路、NOTCH信号通路、MAPK信号通路、MTOR信号通路有关。2.Western blot结果显示,在Ishikawa和KLE细胞中,敲减CDCA8的表达,CyclinD1和CDK6表达减少,CyclinB1和CDC2表达增加,而CyclinA表达减少,证实敲减CDCA8的表达可引起细胞周期阻滞,抑制细胞分裂。在Ishikawa和KLE细胞中,上调CDCA8的表达,CyclinA的表达增加,证实过表达CDCA8可促进细胞DNA合成,促进细胞分裂。3.Western blot结果显示,在Ishikawa和KLE细胞中,敲减CDCA8的表达,信号通路关键分子ERK/p-ERK、Akt/p-Akt的表达下降,而P53和Rb的表达增加;在Ishikawa和KLE细胞中,上调CDCA8的表达,信号通路关键分子ERK/p-ERK、Akt/p-Akt的表达增加,而P53和Rb的表达下降,证实CDCA8基因可能通过ERK/Akt、P53/Rb信号通路发挥作用。结论1.CDCA8基因通过调控子宫内膜癌细胞周期参与调控子宫内膜癌细胞生物学功能。2.CDCA8基因可能通过与肿瘤发生及进展密切相关的ERK/Akt、P53/Rb信号通路发挥作用。