论文部分内容阅读
结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,具有非常高的发病率以及致死率。针对CRC的治疗主要是以手术为主,放化疗为辅,但是可手术的病例通常不到25%且肿瘤复发率高达70%,不能进行手术的复发性或转移性CRC患者通常通过姑息化疗来治疗,但是最终可能会导致细胞毒副作用和耐药性的发生,对患者的免疫系统造成极大的伤害,给病患带来极大的身心痛苦,目前全球范围内正在实施有组织的筛查计划,旨在提高CRC早期发现率并降低其发病率和死亡率,所以积极发掘能够诊断CRC的临床靶标以及研究安全有效且毒副作用小的治疗药物或佐剂来诊断与治疗CRC具有重要的临床意义。研究表明,肿瘤中有一小群具有强大自我更新和多向分化潜能的细胞,它们被称为肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）,长期以来它一直与CRC的发生密切相关,由于基因突变和环境压力,在CRC发展期间CSCs的扩散增加,在CRC晚期阶段,出现肝脏、肺等多器官转移。此外,CSCs介导了肿瘤的化疗抗性和肿瘤复发,因此研究CSCs的自我更新和分化机制对CRC的治疗具有重要的临床意义。在过去的二十年中,基因组学和表观遗传学研究的进步重塑了我们对癌症的理解。癌症不仅仅定义为是一群失调的细胞以不受控制的方式不断生长,而且还应由有助于癌症发生和发展的表观遗传学改变来定义。表观遗传学改变（例如组蛋白修饰和microRNA对基因表达的调控）是干细胞向特定细胞系和组织分化发展编程的关键因素,异常的表观遗传学改变可能会使正常干细胞转变为失去分化能力并获得干细胞样特征的CSCs。此外,有研究表明CSCs是由遗传、表观调控和微环境因素的融合不断形成的动态种群,由于表观遗传机制在调节CSCs特性方面具有重要功能,因此靶向这些表观遗传途径的成分将有助于消除CSCs和大多数的肿瘤细胞群体。PCGF1（Polycomb group factor 1,又被称为 Nervous system polycomb 1,Nspc1）属于PcG（Polycomb Group）蛋白家族,是重要的表观遗传调控因子。PcG蛋白家族在干细胞生物学和发育过程中发挥重要的调控作用。机制方面,主要是通过对组蛋白的表观遗传修饰从而调控基因的转录与表达。PRC1（Polycomb Repressive Complexes 1）和 PRC2（Polycomb Repressive Complexes 2）是两类重要的PcG蛋白复合物,在PRC1中有一类能和Ring1A/B形成二聚复合物的蛋白,称为PCGF蛋白（包括PCGF1-6共6个同源蛋白）,PCGF蛋白的不同在一定程度上解释了 PCR1结构、生物学功能及作用机制的复杂性。PCGF1作为PcG家族中的一员,已经被证明能够通过H2AK119ub1和H3K27me3来抑制基因的转录活性,在干细胞（包括胚胎干细胞以及肿瘤干细胞）的自我更新和胚胎发育方面发挥着重要的表观遗传调控作用。我们前期通过GEDS、SangerBox与GEPIA数据库分析发现,PCGF1在不同类型的肿瘤组织中普遍高表达,且现有研究表明PCGF1在宫颈癌细胞、恶性胶质瘤等肿瘤细胞中能够促进肿瘤细胞增殖与细胞周期进程。在神经胶质瘤干细胞、口腔鳞癌干细胞等CSCs中促进干细胞的自我更新与干性维持。以上研究结果提示PCGF1在肿瘤的发生发展中发挥着重要的调控作用,但是PCGF1在结直肠癌肿瘤细胞以及结直肠癌干细胞（Colorectal cancer stem cells,CCSCs）中的作用及其机制未见相关报道。在上述研究背景下,我们展开了以下实验研究以探究PCGF1在CRC肿瘤细胞以及CCSCs中的调控作用及其作用机制。第一部分PCGF1促进结直肠癌干细胞的富集与增殖我们前期通过GEDS、SangerBox以及GEPIA数据库分析了 PCGF1在不同类型肿瘤中的表达,结果显示PCGF1在多种肿瘤组织中较癌旁组织相比表达升高,这与已有文献研究结果一致。但是,PCGF1是否在CRC中发挥一定的调控作用进而影响肿瘤的发生发展呢?我们在第一部分分析了 PCGF1在CCSCs中的作用,并取得了以下实验结果:（1）我们通过GEDS、SangerBox以及GEPIA数据库分析了 PCGF1在CRC肿瘤组织及其对应癌旁组织中的表达,结果显示PCGF1在CRC肿瘤组织中的表达水平显著高于其对应的癌旁组织。（2）我们利用GEPIA数据库以及Kaplan-Meier Plotter数据库分析了 PCGF1的表达与CRC病患总生存期（Overall survival,OS）之间的关系,结果显示PCGF1的表达与患者的OS呈负相关,即PCGF1高表达患者的OS显著降低（P＜0.05）。我们利用数据库进一步分析了 PCGF1的表达与CRC肿瘤恶性程度（I-IV分级）之间的关系,结果显示PCGF1的表达随着肿瘤恶性程度的升高而升高。我们进一步通过RT-qPCR与Western Blot实验在mRNA以及蛋白水平检测了 PCGF1在正常肠上皮细胞HCoEpiC以及一系列CRC肿瘤细胞系中的表达,结果显示,与HCoEpiC相比,PCGF1在CRC肿瘤细胞系中表达明显升高。（3）我们进一步构建了稳定敲低PCGF1表达的HCT116细胞系以及稳定过表达PCGF1的SW620细胞系,然后诱导了 HCT116-CSCs以及SW620-CSCs,并进一步通过RT-qPCR与Western Blot实验检测了 PCGF1在肿瘤细胞以及诱导的肿瘤干细胞中的表达,结果显示PCGF1在CCSCs中的表达水平明显高于肿瘤细胞。（4）我们通过肿瘤成球实验检测了 PCGF1对肿瘤干细胞成球能力的影响,结果显示PCGF1敲低后,肿瘤球成球能力减弱,肿瘤球变小;PCGF1过表达,肿瘤球成球能力增强,肿瘤球变大。（5）我们通过CCK-8实验以及Ki-67染色检测了 PCGF1对肿瘤干细胞增殖的影响,结果显示,敲低PCGF1后抑制细胞的增殖能力,而过表达PCGF1促进细胞的增殖能力。此外,我们通过流式细胞术以及Western Blot实验检测了PCGF1对肿瘤干细胞凋亡的影响,结果显示PCGF1对细胞的凋亡无显著影响。（6）我们通过裸鼠皮下成瘤实验发现PCGF1敲低后,肿瘤细胞在裸鼠皮下的成瘤能力显著降低。第二部分PCGF1对干细胞自我更新相关信号通路的调控作用第一部分研究结果表明PCGF1促进CCSCs的富集以及增殖,为了深入探究相关机制,我们展开了以下研究并取得了相应的实验结果:（1）首先利用GEPIA数据库分析了 PCGF1与Wnt通路关键蛋白WNT3A、WNT6、LRP6、WNT8A和β-catenin以及干性相关信号通路Notch通路关键蛋白NOTCH1、NOTCH3之间的相关性,数据库结果显示,PCGF1和WNT3A之间（R=0.65;P=0）、和 WNT8A 之间（R=0.78;P=0）、和 β-catenin 之间（R=0.59;P=0）、和 WNT6 之间（R=0.31;P=1.5e-10）以及与 LRP6 之间（R=0.5;P=0）存在正向相关性;PCGF1和NOTCH1之间（R=0.57;P=0）、与NOTCH3之间（R=0.35;P=2.8e-13）存在正向相关性。（2）为了进一步验证上述数据库分析的相关性结果,我们通过RT-qPCR与Western Blot实验检测了 Wnt信号通路关键蛋白β-catenin在mRNA以及蛋白水平的表达,结果显示,降低PCGF1的表达,β-catenin在mRNA以及蛋白水平的表达降低;过表达PCGF1,β-catenin在mRNA以及蛋白表达水平升高。第三部分PCGF1对结直肠癌干细胞增殖的表观遗传调控机制研究PCGF1是重要的表观遗传调控因子,且已有文献证明PCGF1能够通过调控H3K27me3来抑制基因的转录活性,那么PCGF1是否会通过影响组蛋白表观遗传修饰水平进而影响了肿瘤干细胞呢,所以在继第二部分的研究内容后我们进一步检测了 PCGF1对结直肠癌干细胞增殖的表观遗传调控的影响。我们展开了以下研究并取得了相应的实验结果:（1）我们利用GEPIA数据库分析了 PCGF1与CCSCs干性相关标记物CD133、LGR5、CD44、SOX2、ALDH1A1 之间的相关性,结果显示,PCGF1 与CD133 之间（R=0.17;P=0.0027）、与 CD44 之间（R=0.38;P=1.7e-12）、与 SOX2之间（R=0.19;P=0.00092）、与 ALDH1A1 之间（R=0.23;P=3e-05）、与 LGR5之间（R=0.34;P=6e-10）、与Oct4之间（R=0.49;P=0）存在正向相关性。我们进一步通过RT-qPCR、Western Blot以及免疫荧光染色实验验证了数据库的分析结果,实验结果与数据库分析结果一致。（2）我们利用Western Blot实验检测了 PCGF1敲低以及过表达后对肿瘤干细胞增殖的表观遗传修饰水平,结果显示,敲低PCGF1的表达,抑制基因转录的H3K27me3修饰升高,同时促进基因转录的H3K4me3修饰降低;PCGF1过表达,H3K27me3修饰表达降低,H3K4me3修饰表达升高。随后我们利用ChIP-qPCR实验检测了干性相关标记物CD133、CD44和ALDH1A1启动子区域的H3K4me3与H3K27me3的修饰水平,结果显示PCGF1敲低,CD133和CD44启动子区域的H3K4me3表达水平降低,而CD133、CD44和ALDH1A1启动子区域的H3K27me3表达升高。（3）组蛋白修饰水平的变化会受到相关修饰酶的影响,故我们进一步利用RT-qPCR以及免疫荧光染色实验检测了 H3K4me3与H3K27me3甲基转移酶以及去甲基化酶的表达水平,结果显示PCGF1敲低,H3K27me3去甲基化酶KDM6A表达降低,同时H3K4me3甲基转移酶KMT2A表达降低,H3K4me3去甲基化酶KDM5C升高;而PCGF1升高,H3K27me3去甲基化酶KDM6A表达升高,H3K4me3甲基转移酶KMT2A表达也明显升高,而H3K4me3去甲基化酶KDM5C降低。结论与癌旁组织相比,PCGF1在CRC肿瘤组织中的表达升高,且PCGF1的表达随着CRC肿瘤恶性程度的增加而升高。PCGF1过表达促进CCSCs的富集与增殖,且体内实验进一步证实了体外实验的结果。关于机制的研究,一方面PCGF1与干细胞自我更新相关信号通路中的关键蛋白存在正向相关性且能够调控Wnt信号通路中β-catenin蛋白的表达。另一方面,PCGF1通过对CCSCs增殖的表观遗传调控进而影响CCSCs干性相关标记物的表达。我们的研究表明PCGF1具有作为CRC诊断治疗的潜在生物学靶点的潜质。创新性:1.我们研究了 PCGF1在CRC中的表达并发现PCGF1在肿瘤组织中表达升高,随着CRC肿瘤恶性程度增加PCGF1表达升高,且PCGF1与CRC肿瘤病患的愈后总生存期呈负相关。2.通过体内、体外实验研究发现PCGF1促进CCSCs的富集以及增殖。3.PCGF1通过调控CCSCs自我更新相关信号通路中关键蛋白的表达以及CCSCs干性相关标记物启动子区域的组蛋白甲基化水平进而影响了 CCSCs的富集。为CRC的临床诊断提供了潜在的治疗靶点。