论文部分内容阅读
1.研究背景鼻息肉（Nasal polyps,NP）是鼻部多发病。呈现外生型生长,可突入鼻腔或者鼻窦内使得炎性新生物堵塞鼻腔或者鼻窦口,导致窦内气体无法与外界交换,黏液无法排出,诱发慢性鼻-鼻窦炎（CRS）,患者常表现为粘脓涕、头部不适,嗅觉减退等症状。鼻息肉病理组织学特点呈间质高度水肿,大量炎性细胞浸润,鼻息肉常伴有上皮增生、鳞状化生及杯状化生等表现。鼻息肉的发病机制至今仍未完全明了,多种致病因素导致的息肉发生发展与其高复发率相关,对患者生活质量造成了极大影响,同时也加重了个人与国家的医疗负担。NP的上皮异常增生部位主要位于基底层,但导致上皮基底层细胞过度增殖的原因尚不清楚。脑神经营养因子（Brain derived neurotrophic factors,BDNF）,具有多种生理功能,在正常鼻粘膜及NP中的表达模式并不清楚。BDNF可通过生长因子类受体TRKB作用于细胞内PI3K/AKT通路促进细胞的增殖活性并可抑制细胞的程序性死亡,广泛参与多种炎症过程及肿瘤的发生。在肺部肿瘤组织中也可以检测到BDNF的表达相比于正常对照有显著升高。中枢神经系统的炎性疾病中BDNF的表达较正常组织上调,且在过敏性鼻炎患者鼻腔灌洗液中BDNF表达上调。因此我们拟研究BDNF在正常鼻粘膜和鼻息肉中的表达及其对上皮细胞异常增殖与凋亡的影响,揭示BDNF在NP发生发展过程中发挥的重要作用。2.实验方法24例鼻息肉样本和24例的正常对照（healthy control）样本取自山东省耳鼻喉医院。所取样本均经HE染色鉴定,符合鼻息肉的病理组织学特点并被病理科医生诊断为鼻息肉。我们将收集到的样本分为3等份,其中一份用4%的PFA浸泡,进行组织切片。剩余两份分别提取总核糖核酸（RNA）和组织蛋白。2.1人鼻上皮干细胞体外分化模型的建立在实验室内将健康对照的下鼻甲黏膜上皮用分散酶及胰酶解离,获得上皮细胞,应用气道上皮增殖培养基培养上皮细胞,获得具有干性的鼻上皮细胞,待上皮干细胞增殖到足够量后应用Transwell小室建立气-液细胞分化模型。应用气道上皮分化培养基培养4周后获得分化完成的鼻上皮细胞。收取细胞进行免疫荧光检测。2.2鼻上皮细胞转染及药物刺激将鼻上皮细胞系转染BDNF过表达质粒,并滴加高浓度LPS刺激细胞模拟炎症对细胞的伤害作用。将细胞分为4组:正常对照组;BDNF过表达组;BDNF过表达+LPS组;LPS组。刺激细胞48小时,收取细胞进行免疫荧光、qPCR及WB检测。2.3免疫组织化学染色及免疫荧光染色对健康对照和鼻息肉组织的石蜡切片进行免疫组织化学（Immunohistochemical,IHC）染色、免疫荧光（Immunofluorescences,IF）染色,明确BDNF在NP和健康对照中的表达。通过软件分析BDNF在健康对照和鼻息肉中的光密度值计算其在健康对照与鼻息肉中的表达量。通过免疫荧光染色,对BDNF与息肉上皮的基底细胞、纤毛细胞、杯状细胞的特异性标志物进行共染,确定BDNF在鼻息肉上皮中的表达模式。对磷酸化的AKT与基底细胞标志物进行共染,分析磷酸化的AKT在健康对照在鼻息肉上皮基底细胞中的表达。通过对鼻上皮干细胞体外分化模型IF染色确定鼻上皮细胞中BDNF在不同细胞中的表达。对HNECs进行免疫荧光染色分析BDNF在不同实验条件下的表达。2.4 qPCR通过提取组织总RNA,进行qPCR检测TRKB/PI3K/AKT信号通路相关分子TRKB、PI3K、AKT的表达以及AKT下游与增殖相关的细胞因子KI67、CDK2、CyclinE1、CyclinA2的mRNA在健康对照及NP组织中的表达,检测和凋亡相关的细胞因子如Caspase-9、Caspase-3、BAX的mRNA表达,检测抑制凋亡的BCL-2在健康对照及NP中mRNA的表达。提取鼻上皮细胞系（HNECs）总RNA并进行qPCR检测,分析不同刺激条件下HNECs的增殖活性,检测与增殖相关细胞因子KI67、CDK2、CyclinE1、CyclinA2的mRNA的表达,检测与凋亡相关的细胞因子如 Caspase-9、Caspase-3、BAX 的 mRNA 表达。2.5 Western Blotting检测健康对照与NP组织中与细胞增殖相的KI67、CDK2、CyclinE1、CyclinA2的表达;检测凋亡相关因子的表达。对细胞增殖与凋亡相关的上述细胞因子蛋白表达水平进行检测。3.研究结果3.1 BDNF可表达于健康对照及NP组织的上皮及上皮下。并且BDNF在NP中表达上调。NP上皮的基底细胞占BDNF阳性细胞数的比例最高,所占比例达60%,纤毛细胞约占30%;杯状细胞中约占10%。3.2在NP中,TRKB/PI3K/AKT信号通路相关细胞因子如TRKB、PI3K、p-AKT的表达量相比较与健康对照明显上调,CyclinA2、CyclinE1、CDK2、KI67等表达上调,P21表达下调。3.3我们进一步分析了 AKT直接作用的下游与凋亡相关的细胞因子Caspase-9及Caspase-9下游的细胞因子Caspase-3的表达量,我们发现与健康对照相比Caspase-3/9在NP中表达下调。与凋亡相关的细胞因子BAX的表达在NP中下调,BCL-2的表达上调。3.4 BDNF与KI67进行相关性分析发现两者呈明显的正相关性,进一步对HNECs细胞系BDNF进行基因过表达并施加高浓度LPS诱导细胞凋亡后检查mRNA及蛋白表达水平,我们发现BDNF可以抑制高浓度LPS导致的细胞凋亡,并且可以刺激TRKB/PI3K/AKT信号通路的活化,导致与增殖相关的细胞因子分如KI67、CDK2、CyclinE1等的分泌增加,而与细胞程序性死亡相关的细胞因子如Caspase-3、Caspase-9的表达下降。BDNF还可抑制P21的表达,促进细胞周期。4.结论BDNF在NP上皮中可通过TRKB/PI3K/AKT信号通路促进上皮层基底细胞的异常增殖并抑制其凋亡,导致NP上皮增生,有可能影响了 NP的发生发展。BDNF可以被当做一个潜在靶点来治疗NP。1.研究背景鼻内翻乳头状瘤（NasallnvertedPapilloma,NIP）作为仅次于鼻息肉的鼻腔常见良恶交界性肿瘤,其发病机制目前为止研究不十分透彻,其病理特点常被描述为:上皮细胞增生明显,并且突入到上皮下形成乳头样的病理特征性改变;大量的炎性细胞浸润,其中占比最高的为中性粒细胞;上皮与上皮下基质之间存在完整基底膜将上皮与基质分隔。但是对于NIP的病理形成机制及发生发展的相关研究甚少。我们仔细观察了NEP的组织病理学特点,发现其上皮的基底膜存在破坏,并且内翻的上皮中存在大量的炎性细胞的浸润,这表明可能浸润的炎性细胞在其发病机制中发挥重要作用。能够溶解基质及基底膜的主要成分为基质金属蛋白酶（MatrixMetalloproteinase,MMP）,可以影响MMPs的表达的分子包括低氧诱导因子（HypoxiaInduceFactorl alpha,HIF-la）。因此,我们想通过对鼻内翻乳头状瘤内MMP及HIF-la的研究来进一步阐明鼻内翻乳头状瘤的发病机制。2.研究方法收集了鼻内翻乳头状瘤样本37例,正常对照24例,通过HE和免疫组织化学染色分析NEP的基本组织病理学特点,并检测了MMPs和他们的抑制剂-组织金属蛋白酶抑制因子（Tissue inhibitorofmetalloproteinases,TIMPs）在健康对照及NEP中的表达部位及表达量,同时还检测了HIF-la在健康对照及NIP中的表达部位与表达量的差异;通过免疫荧光染色我们对MMP-9在炎性细胞中的表达进行了分析,明确了在NIP中那种炎症细胞分泌MMP-9最多;qPCR及蛋白免疫印迹等检测方法可以定量的分析MMPs和TIMPs在NIP和健康对照中的差异。通过上述检测手段,研究鼻内翻乳头状瘤的病理发生机制。3.研究结果通过HE染色,我们发现鼻内翻乳头状瘤的上皮增生,并且出现弯折、挤压变形等特征,上皮增生明显。与正常对照组织相比,上皮下基底膜变薄。上皮下基质突入上皮内形成多个“指状突起”结构。指状突起中包含成纤维细胞,炎性细胞（以中性粒细胞为主）,新生毛细血管以及基质胶原。而且在指状突起的顶部或者周围存在大量的基底膜被破坏的情况,尤其是中性粒细胞聚集部位,存在基底膜不连续,基底膜内扦插有炎性细胞的现象。MMP-1及MMP-7主要的表达部位为鼻内翻乳头状瘤的上皮细胞中,MMP-9则主要是由中性粒细胞分泌,它的组织分布与指状突起的部位呈现高度的一致性,并且MMP-9在鼻内翻乳头状瘤中的升高趋势最明显。在鼻内翻乳头状瘤中MMPs的表达是上调的,相反的他们的抑制因子即金属蛋白酶组织抑制剂的表达量在鼻内翻乳头状瘤中却是下调的。HIF-la同MMP存在共定位现象,并且其表达量在鼻内翻乳头状瘤中呈明显上调趋势。4.结论鼻内翻乳头状瘤中过度浸润的中性粒细胞分泌大量的MMP-9以及HIF-la,破坏了基底膜的基本结构,使得上皮下基质突入到上皮中,并造成上皮的弯折与卷曲。使得鼻内翻乳头状瘤呈现出极具特点的病理形态。