论文部分内容阅读
肺癌是我国乃至世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,主要病理类型为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）。其主要治疗手段包括手术治疗、化学治疗、放射治疗、靶向治疗及免疫药物治疗,其中放射治疗是肺癌晚期患者的重要治疗手段。然而,肺癌患者对放射治疗的敏感性存在很大差异,尤其是非小细胞肺癌患者。在精准医学时代,区分放疗敏感性不同的非小细胞肺癌患者,积极寻找放疗增敏的靶点,对患者治疗方式的选择和治疗结果的改善都有重要意义。近年来,对肿瘤放疗耐受机制的研究逐渐增多。DNA损伤修复,细胞周期,线粒体功能,肿瘤干细胞,肿瘤乏氧,细胞自噬等生物信号通路和细胞进程的异常均可影响肿瘤的放射敏感性。放射损伤所诱导的细胞多种形式程序性死亡中,自噬在肿瘤细胞应对放射损伤时具有双重作用,是本课题重点关注的。一方面,自噬可引起肿瘤细胞死亡;另一方面,自噬也可成为肿瘤细胞应对放射损伤的自我保护行为,从而引起放射耐受。研究发现,自噬抑制剂或诱导剂可影响放疗、化疗等治疗手段在卵巢癌,食管癌,黑色素瘤等疾病中的作用,但对肿瘤放疗敏感性的作用尚无定论。与大多数通路一样,微小RNA（micro RNA,miRNA）也可作用于自噬相关通路上的信使RNA（messenger RNA,mRNA）,从而影响细胞自噬水平。例如,Wang等发现miR-23b可以通过靶向ATG12影响细胞自噬水平,从而调节胰腺癌细胞的放疗敏感性。然而,miRNA通过调节细胞自噬水平,从而影响NSCLC放疗疗效的研究仍需进一步深入。miRNA是一类长度为21-23核苷酸的非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）。由于相对稳定、普遍存在,同时具有组织特异性的特征,miRNA作为肿瘤诊断和预后标志物的潜能逐渐显露。另外,它们可以通过靶向结合mRNA的3非翻译区进行转录后调节,抑制基因的翻译并引起降解,从而影响许多生物信号通路和细胞进程,如增殖,分化和细胞死亡等。因此,miRNA广泛参与肿瘤的发生发展过程,是肿瘤相关信号通路中重要的调节分子,在肿瘤和正常组织间显著差异表达,具有作为诊断和预后标志物的潜能。本文中重点研究参与放射后自噬过程调节的miRNA,观察其对自噬的调节作用和对NSCLC放疗敏感性的影响,并确定其下游靶基因及作为放射敏感性标志物的潜能。环状RNAs（circular RNA,circRNA）是另一类重要的ncRNA,它们具有完全的闭环结构,但没有传统RNA帽子结构或多聚腺嘌呤尾。随着技术的发展,circRNAs因其结构稳定性和细胞类型特异性,成为研究肿瘤标记物和治疗靶点领域的“新星”。CircRNA 存在大量 miRNA 反应元件（miRNA response elements,MREs）,通过结合miRNA形成“海绵”结构,从而自然分离并竞争性抑制miRNA的活性,间接调节其靶基因的生物学功能。本课题将进一步研究调控miRNA的上游circRNA。综上所述,miRNA、细胞自噬、circRNA均可在肿瘤放疗敏感性调节中发挥作用,并且存在相互作用关系。然而,尚未发现一条明确的调控NSCLC放疗敏感性的circRNA-miRNA-自噬相关基因调节轴。本研究首先获取NSCLC放疗耐受细胞系与母细胞的miRNA差异表达谱,经过生物信息学分析,确定miR-1246为后续研究分子,并结合体内外实验和临床队列,证实了 miR-1246可引起NSCLC细胞放射耐受并可作为患者放疗预后的潜在标记物。机制研究发现,miR-1246影响细胞自噬水平,并靶向自噬相关基因 mTOR;上游 circRNA Hsa＿circ＿0001946 可拮抗 miR-1246 对 NSCLC 放疗耐受的作用,从而形成调控NSCLC放疗敏感性的Hsa＿circ＿0001946-miR-1246-mTOR的调节轴。第一部分NSCLC细胞放疗敏感性相关miRNA的筛选和验证[目的]筛选与NSCLC细胞放疗敏感性相关的miRNA,并选定后续研究的miRNA。[方法]1.建立NSCLC细胞系（A549,PC9）的放疗耐受细胞系,通过克隆形成实验验证其与母细胞放疗敏感性的差异。2.使用miRNA表达谱芯片筛选NSCLC放疗耐受细胞系与母细胞系差异表达的miRNA。3.通过疾病相关公共数据库挖掘,筛选肺癌与正常组织差异表达的miRNA,选定后续研究的miRNA;使用qRT-PCR的方法,验证该miRNA在NSCLC放疗敏感和耐受细胞系中差异表达。4.进行细胞及动物实验,验证miR-1246表达含量的改变对NSCLC细胞放射敏感性的影响。[结果]1.建立NSCLC放疗耐受细胞系并命名为A549-R和PC9-R,其对应母细胞系分别为A549和PC9;克隆形成实验显示,A549-R和PC9-R的放疗耐受性高于母细胞系。2.miRNA表达谱芯片分析发现,相比于A549细胞,A549-R细胞有7个miRNAs上调和20个miRNAs下调;相比于PC9细胞,PC9-R细胞有66个miRNAs上调和4个miRNAs下调。3.通过miRCancer数据库挖掘,共计得到210个miRNAs在肺癌和正常组织中差异表达;与NSCLC细胞系中测定的放疗敏感性相关miRNA取交集后,获得5个共同差异的 miRNAs（miR-1290,miR-1246,miR-330-3p,miR-1469,and miR-5100）;通过ENCORI泛癌分析平台进一步筛选后,miR-1246被选定为最终研究对象;经qRT-PCR实验验证,miR-1246在NSCLC放疗敏感和耐受细胞系中表达水平有显著差异。4.克隆形成实验显示,miR-1246过表达增加NSCLC细胞放疗耐受性,表达下调增加NSCLC细胞放疗敏感性;通过裸鼠成瘤实验证实miR-1246过表达或表达下调可显著降低或增加NSCLC放疗敏感性。[结论]1.NCSLC放疗耐受细胞系与敏感细胞系中存在差异表达的miRNA。2.miR-1246既在NSCLC患者肿瘤与正常组织中差异表达,又在NSCLC放疗耐受细胞系与其母细胞系中差异表达。3.无论在细胞还是动物水平,miR-1246均可影响NSCLC细胞放疗敏感性。第二部分 miR-1246与临床病理因素的相关性及其作为预后标志物潜能[目的]探究miR-1246与NSCLC患者临床病理因素的相关性,及其对接受放疗的NSCLC患者预后的预测作用。[方法]1.检索TCGA中的NSCLC患者,获取其临床病理因素及肿瘤组织中miR-1246表达水平信息,分析miR-1246表达水平与临床病理因素的相关性。2.招募接受放疗的NSCLC患者,收集其治疗前血清样本,石蜡包埋活检组织和临床病理及预后信息,使用qRT-PCR检测miR-1246的表达水平,分析miR-1246表达水平与患者放疗敏感性及总体生存期（Overall survival,OS）的关系。[结果]1.在TCGA中共检索得到309名NSCLC患者;相对于肺腺癌患者,miR-1246的表达水平在肺鳞癌患者中更高;疾病有进展的患者,miR-1246表达水平高;而miR-1246表达水平与患者年龄,性别,吸烟数量,TNM分期无关。2.获取112名非小细胞肺癌患者的血清样本及其中87名患者的石蜡包埋肿瘤活检组织;血清或石蜡组织中miR-1246表达水平与临床病理因素无关;血清或石蜡组织中miR-1246高表达的患者,其放疗敏感性较差;血清中miR-1246表达水平较高的患者,OS较短,石蜡组织中miR-1246表达水平高低与OS无关。[结论]1.TCGA数据库中NSCLC患者miR-1246表达水平与病理类型和疾病进展相关。2.NSCLC患者治疗前血清miR-1246表达水平可用于预测放疗敏感性及OS;石蜡组织中miR-1246表达水平可用于预测放疗敏感性。第三部分 公共数据库挖掘细胞自噬对NSCLC患者放疗疗效的影响[目的]挖掘自噬相关基因及基因集,探究其对NSCLC患者放疗反应的影响;探索NSCLC细胞放疗敏感性相关miRNA及miR-1246与自噬通路的关系。[方法]1.通过Gene Ontology（GO）资源库挖掘自噬相关基因及基因集,筛选肿瘤基因图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中接受放疗的NSCLC患者,并按照放疗敏感性进行分组。2.利用上述患者的RNA-seq数据,使用单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis,ssGSEA）和基因集变异分析（gene set variation analysis,GSVA）方法计算自噬相关基因集得分,分析其在NSCLC患者放疗敏感组与耐受组中的差异。3.利用自噬相关基因集得分,探究其与NSCLC患者临床及病理因素的相关性及是否可作为NSCLC患者放疗敏感性和总生存期（Overall Survival,OS）的独立危险因素。4.对第一部分中使用miRNA表达谱芯片筛选NSCLC放疗耐受细胞系与母细胞系差异表达的 miRNA 进行 Gene Ontology（GO）和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析;探索NSCLC敏感性相关miRNA及miR-1246与自噬模块的关系。[结果]1.获取537个自噬相关基因和9个自噬相关基因集（巨自噬,线粒体自噬,溶酶体微自噬,过氧化物酶体自噬,次级内体微自噬,核自噬,分子伴侣介导的自噬,自噬调节及宿主自噬共生体调控）;筛选到87个接受放疗且有反应评价的NSCLC患者,其中39名患者对放疗耐受,48名患者对放疗敏感。2.分别获取不同自噬相关基因集的GSVA和ssGSEA得分,发现次级内体微自噬在放疗耐受和放疗敏感的NSCLC患者中存在差异。3.巨自噬及线粒体自噬与NSCLC患者组织类型相关,过氧化物酶体自噬、核自噬、次级内体微自噬及宿主自噬共生体调控与NSCLC患者性别和组织类型相关;多因素逻辑回归分析显示,溶酶体微自噬和次级内体微自噬是NSCLC患者放疗敏感性的独立危险因素。4.本研究中获得的NSCLC细胞放疗敏感性相关的miRNA在GO和KEGG富集分析的自噬模块中均有富集,可作为NSCLC放疗反应的潜在调节机制;其中,miR-1246与自噬阳性调节（positive regulation of autophagy GO:0010508）相关。[结论]1.次级内体微自噬在放疗耐受和放疗敏感的NSCLC患者中存在差异。2.自噬相关基因集与临床病理因素存在密切相关性。3.NCSLC细胞系放疗敏感性相关的差异表达miRNA在自噬中富集,可作为潜在调节机制。第四部分 miR-1246靶向mTOR激活自噬引起NSCLC细胞放疗耐受[目的]验证miR-1246对NSCLC细胞放疗敏感性及自噬水平的影响,探讨其下游靶基因。[方法]1.进行Western blot及透射电子显微镜实验,观察miR-1246对基础水平及经放射线处理后的NSCLC细胞自噬水平的影响。2.预测miR-1246的靶基因,并通过qRT-PCR,双荧光素酶报告基因及免疫组化实验,检测miR-1246对靶基因作用。3.通过靶基因拯救实验,证明miR-1246通过激活靶基因介导的自噬水平改变影响细胞放疗敏感性。[结果]1.Western blot及透射电子显微镜实验显示,NSCLC细胞无论在基础水平还是经照射后,过表达miR-1246引起细胞自噬水平增高。2.经数据库预测,mTOR为miR-1246的靶基因;双荧光素酶报告基因检测实验证实,miR-1246直接作用于mTOR;qRT-PCR和动物组织免疫组化实验证实,过表达miR-1246引起mTOR的mRNA和蛋白表达降低,降表达miR-1246引起mTOR的mRNA和蛋白表达增高。3.靶基因拯救实验显示,mTOR过表达可拮抗miR-1246过表达引起的NSCLC细胞放疗耐受。[结论]1.无论在NSCLC细胞基础水平还是经放射刺激后,miR-1246均可影响其自噬水平。2.在NSCLC细胞中,自噬相关基因mTOR是miR-1246的作用靶基因。3.过表达mTOR可拮抗miR-1246过表达引起的NSCLC细胞放疗耐受。第五部分 Hsa＿circ＿0001946对miR-1246的调控作用[目的]探索与miR-1246相互作用的circRNA分子,探究其对miR-1246调控NSCLC细胞放疗敏感性的影响。[方法]1.通过数据库预测与miR-1246相互作用的circRNA及人类肺组织中高表达的circRNA,确定后续研究分子及其与miR-1246的结合位点。2.通过双荧光素酶报告基因检测,RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）实验,RNA下拉（RNA pull down）实验等,验证在NSCLC细胞中Hsa＿circ＿0001946与miR-1246的相互作用。3.通过NSCLC细胞中过表达Hsa＿circ＿0001946,探究其对miR-1246调控NSCLC细胞放疗敏感性的影响。[结果]1.通过circBank数据库预测得到4568个与miR-1246相互作用的circRNAs分子,结合人类肺组织中最高表达的30个circRNAs分子,确定Hsa＿circ＿0001946为后续研究对象,并获得其与miR-1246的结合位点。2.双荧光素酶报告基因检测实验显示,在A549和PC9细胞中,转染miR-1246激动剂可使野生型质粒萤火虫荧光素活性降低,但不可使突变型质粒萤火虫荧光素活性降低;RNA结合蛋白Argonaute-2（Ago-2）免疫共沉淀实验结果显示,在A549和PC9细胞中,Hsa＿circ＿0001946与miR-1246均可与Ago-2蛋白结合;捕获蛋白介导以MS为标签的Hsa＿circ＿0001946下拉实验结果显示,Hsa＿circ＿0001946与miR-1246相互结合。3.克隆形成实验显示,在A549和PC9细胞中,转染Hsa＿circ＿0001946过表达质粒可拮抗miR-1246过表达引起的细胞放疗耐受。[结论]1.Hsa＿circ＿0001946在人类肺组织中高表达,并与miR-1246相互作用;2.Hsa＿circ＿0001946可拮抗miR-1246引起的NSCLC细胞放疗耐受。