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研究背景和意义食管癌是全球常见的恶性肿瘤之一,2020年赫捷院士团队的流行病学数据显示,我国食管癌年新发病例数为24.6万,占全球病例总数的43%;年死亡人数为18.8万,其发病率和死亡率分别居我国恶性肿瘤的第6位和4位。目前而言,食管癌分期是确定治疗策略的主要依据。局限于黏膜层内的早期食管癌主要应用内镜下局部切除（包括粘膜剥离术和粘膜切除术）或内镜下能量治疗（如光动力治疗、激光治疗、射频消融术等）。对于侵及黏膜下层的中早期食管癌,外科切除是最有效的治疗措施之一。食管癌手术不仅需要彻底切除病灶,还需彻底的淋巴结清扫。据报道,食管癌术后淋巴结复发率约20%-40%,且以上纵隔和颈部为主。日本学者Isono于1991年报道的多中心回顾性研究提示:采取左颈、右胸、上腹三切口食管癌切除+颈部、胸部及上腹部的淋巴结清扫的McKeown术式降低了术后淋巴结复发率,使日本食管癌患者的5年生存率由两野清扫的26.7%增加至34.3%,因此日本许多学者开始采用McKeown术式。但该术式增加创伤且操作复杂、术后并发症多,尤其是行喉返神经旁淋巴结清扫时会导致喉返神经损伤并继发肺部感染等并发症产生。研究显示并非所有患者都能从清扫喉返神经旁淋巴结中获益,如日本学者Taniyama的研究发现对胸下段及腹段食管癌而言,是否行该部位淋巴结的清扫其5年生存率无统计学差异,对于喉返神经旁淋巴结阴性及喉返淋巴结广泛转移者行该部位清扫均无价值。因此,治疗前准确评估该处淋巴结转移情况对确定手术入路及淋巴结清扫程度有重要的指导意义。目前,螺旋CT仍然是判断肿瘤侵犯程度及淋巴结转移状况时最常用的检查方法。影像学专家判断淋巴结转移时,通常以短径1厘米为分界,其敏感性及特异性均低于80%,且不同部位的淋巴结共用同一标准显然不妥,但目前探讨食管癌喉返神经旁淋巴结CT诊断标准的研究有限。本研究的第一部分将对食管癌喉返神经旁淋巴结CT诊断标准进行探讨。预测和影响喉返神经旁淋巴结转移状态的因素有多种,单一以CT或其他某种检查方法判断淋巴结的转移状态都存在准确性不高的问题。数学预测模型是综合临床中的多个危险因素或检查方法进行量化加权后得出的数学公式。Logistic多因素回归分析作为特殊的概率预测数学模型在临床上应用越来越广泛。2003年,美国纽约Memorial Sloan-Kettering肿瘤中心的Van Zee教授通过对来自11个研究中心的702例发现前哨淋巴结转移后清扫腋窝淋巴结的乳腺癌患者的临床病理资料进行多元回归分析,筛选出与腋窝淋巴结转移有关的8个危险因素,并建立预测乳腺癌患者前哨淋巴结阳性时非前哨淋巴结转移可能性的MSKCC列线图模型,该模型被刊登于Memorial Sloan-Kettering肿瘤中心的网站上并被在世界范围内广泛验证,得到的AUC（曲线下面积）值为0.58-0.86,具有较高的准确性。本研究的第二部分通过对食管癌患者中预测和影响喉返神经旁淋巴结转移状态的因素进行logistic回归分析,建立数学预测模型以计算该处淋巴结转移概率,为喉返神经旁淋巴结的转移状况提供了较为有效的预测方法,从而为患者的个体化治疗提供参考依据,指导临床治疗。为进一步提高我们预测胸段食管癌喉返神经旁淋巴结转移的准确性,我们希望通过增加分子诊断指标以进一步提高我们的食管癌淋巴结转移的预测及认识。另外,影响肿瘤发生发展的相关分子指标通常对其病变程度、复发转移情况及预后密切相关,对其深入研究有利于评估病变复发及远期生存。增殖细胞核抗原（Ki-67）是目前被广泛应用的肿瘤细胞的潜在增殖标志物,对预测肿瘤的恶变有一定的参考价值。有研究显示其在正常食管向异型增生及食管癌演变的不同阶段表达率逐渐升高,有利于对早期食管癌及癌前病变的区分。微小染色体维持蛋白7（Minichromosome Maintenance Proteins 7,MCM7）是一种新的增殖指标,在细胞的复制过程中高表达,但不受DNA修复影响,有更好的特异性,因此有学者建议将其作为监测细胞增殖过程的可靠生物标志物。既往研究发现在多种人类恶性肿瘤细胞中如非小细胞肺癌、肝细胞癌、神经母细胞瘤等肿瘤中都存在着MCM7过表达或扩增现象。平足蛋白（Podoplanin,PDPN）与肿瘤的恶性进展,如上皮间质转化及远处转移及浸润等紧密相关。PDPN可促进包括口腔鳞状细胞癌,膀胱肿瘤、脑肿瘤等多种肿瘤的进展和转移,但其与食管鳞癌发生发展的关系尚不明确。本研究的第三部分探讨了 MCM7、Ki-67、Podoplanin在食管鳞癌中的表达与其临床病理特征（如淋巴结转移状况、肿瘤浸润深度、分化程度）的相关性及其在预后预测方面的临床价值。另外,我们从细胞学水平观察了Ki-67和Podoplanin对食管癌细胞的生物学行为的影响,为准确预测食管癌病情和选择肿瘤治疗靶点提供理论依据。第一部分 螺旋CT多平面重建技术对胸段食管癌喉返神经旁淋巴结转移诊断标准探讨（本部分已发表于中国胸心血管外科临床杂志,2020,27（10））[研究目的]:探讨螺旋CT多平面重建技术对胸段食管癌喉返神经旁淋巴结转移状态的诊断价值及最佳诊断标准。[研究方法]:收集中国人民解放军第九六〇医院2016年12月至2019年6月间行食管癌根治切除术的138例胸段食管癌患者的临床资料,分别统计左、右两侧喉返神经旁淋巴结的转移率。对其术前的多层螺旋CT扫描数据应用多平面重建技术进行图像后处理,测量双侧喉返神经旁淋巴结的短径、长径,并计算短径长径比。分别将上述三个参数与术后病理结果对照,绘制上述三个指标对预测相应淋巴结转移状态效果的ROC曲线,比较临床中采用不同诊断标准的敏感性及特异性。[结果]:本研究纳入的138例患者中男113例,女25例;平均年龄63.03±15.58岁。共清扫左侧喉返神经旁淋巴结291枚,平均每例清扫2.11±0.41（0-14）枚,转移率16.70%;右侧喉返神经旁清扫436枚,平均每例清扫3.16±0.45（0-17）枚,转移率21.00%;喉返神经旁淋巴结总转移率29.7%。以左侧喉返神经旁淋巴结短径、长径及短长径比为诊断标准计算出的ROC曲线下面积分别为0.808、0.779、0.621。以左侧喉返神经旁淋巴结短径＞3.10mm为诊断标准,诊断该侧转移的敏感性91.3%,特异性41.7%。以右侧喉返神经旁淋巴结短径、长径及短长径比为诊断标准计算出的ROC曲线下面积分别为0.865、0.807、0.637。以右侧喉返神经旁淋巴结短径＞5.68mm为诊断标准,诊断该侧转移的敏感性96.6%,特异性67.9%。[结论]:1、淋巴结短径较淋巴结长径及短径长径比对判断左、右侧喉返神经旁淋巴结转移状态具有更高的诊断效能。2、分别以左侧喉返神经旁淋巴结短径＞3.10mm和右侧喉返神经旁淋巴结短径＞5.68mm为诊断标准,具有较高的临床参考意义。第二部分 胸段食管鳞癌喉返神经旁淋巴结转移预测模型的建立及验证[研究目的]:分析胸段食管鳞癌喉返神经旁淋巴结转移的危险因素,建立预测该处淋巴结转移情况的列线图模型并验证。[研究方法]:收集解放军第九六〇医院及山东大学第二医院2015-1-1到2018-6-1的265例胸段食管鳞癌患者的术前基本信息（性别、年龄）、辅助检查结果（CT所示左、右喉返神经旁淋巴结短径大小,病变位置）及术后病理情况（食管旁淋巴结阳性与否、肿瘤最大径、T分期、隆突下淋巴结阳性与否、双侧喉返神经旁淋巴结情况）。通过单因素分析初步筛选其相关危险因素,对初筛后的因素进行多因素分析并建立logistic回归模型。绘制Nomogram图,采用校准曲线进行校准度评估,通过ROC曲线和曲线下面积评价模型的区分度。通过Bootstrap法对模型性能进行了内部验证,并用2018年7月至2020年10月收集到的114名连续患者作为独立验证数据集进行外部验证。[结果]:265例患者中,222例为男性,43例为女性,共清扫淋巴结6255枚,平均23.60±1.04（7-58）枚。左喉返神经旁淋巴结2.34±0.33（0-16）枚,转移率为15.10%。右喉返神经旁淋巴结2.94±0.31（0-17）枚,转移率为20.40%。喉返神经旁淋巴结的总转移率为28.3%。经单因素分析筛选危险因素后行logistic回归多因素分析显示:（1）胸段食管癌该处淋巴结转移的独立危险因素有肿瘤最大径、隆突下淋巴结转移、食管旁淋巴结转移、胸上段肿瘤、左喉返神经旁淋巴结短径大于5mm、右喉返神经旁淋巴结大于5mm。根据上述危险因素建立Nomogram模型的ROC曲线下面积（AUC）为0.809（95%CI:0.751-0.861）。Hosmer-Lemeshow检验计算:X2=4.390,p=0.820＞0.05。校准曲线显示训练集和验证集中的预测值与实际观测值吻合均较好。其训练集和外部验证集的Bootstrap校正AUC分别为0.809（95%CI:0.751～0.861）和0.819（95%CI:0.733～0.895）。（2）左喉返神经旁淋巴结短径大于5mm是胸段食管鳞癌左喉返神经旁淋巴结转移的独立危险因素。（3）胸段食管癌右喉返神经旁淋巴结转移的独立危险因素有:右喉返神经旁淋巴结短径大于5mm、隆突下淋巴结转移、胸上段。根据上述危险因素建立Nomogram模型的ROC曲线下面积（AUC）为0.868（0.812-0.916）。Hosmer-Lemeshow检验计算:X2=1.735,p=0.988＞0.05。校准曲线显示训练集和验证集中的预测值与实际观测值吻合均较好。其训练集和外部验证集的Bootstrap校正AUC分别为0.868（0.812-0.916）和0.893（0.828-0.946）。[结论]:胸段食管鳞癌两侧喉返神经旁淋巴结转移率较高,右侧高于左侧。应用Nomogram模型可预测喉返神经旁淋巴结转移的可能性,具有较高的临床实用价值。第三部分 MCM7、Ki-67、Podoplanin在食管癌中的应用价值及其对食管癌细胞生物学行为的影响[研究目的]:观察MCM7、Ki-67和Podoplanin与食管鳞状细胞癌临床病理因素和临床预后之间的相关性。观察Ki-67、Podoplanin对食管癌细胞系生物学行为的影响。[研究方法]:本研究共纳入105例胸段食管鳞癌患者,采集其临床信息,包括其分化程度、淋巴结转移状况、肿瘤分期、TNM分期、无进展生存期和总生存期。采用免疫组化S-P法检测食管鳞状细胞癌中MCM7、Ki-67和Podoplanin的表达。比较其表达与胸段食管鳞癌分化程度、T分期、淋巴结状况等临床病理因素和无进展生存期、总生存期的关系。为观察Ki-67、Podoplanin蛋白对食管癌细胞生物学行为的影响,我们在食管癌细胞系KYSE150中敲低Ki-67及PDPN的表达,通过CCK8、EdU及克隆形成实验观察其增殖能力变化,通过Transwell和划痕实验观察侵袭和迁移能力变化。[结果]:1、Ki-67蛋白表达与胸段食管鳞癌分化程度（p＜0.001）、淋巴结转移状况（p=0.006）有关,Podoplanin蛋白表达与T分期（p=0.008）有关,其差异均有统计学意义。2、MCM7蛋白低表达和高表达的胸段食管鳞癌患者术后中位PFS分别为40个月和24个月,P=0.042,两者差异有统计学意义。3、CCK8、EdU及克隆形成实验显示Ki-67及PDPN干扰组KYSE150细胞增殖能力均下降,Transwell和划痕实验显示Ki-67及PDPN干扰组KYSE150细胞的迁移、侵袭能力均降低。[结论]:1、Ki-67及PDPN表达在食管鳞癌细胞的增殖及迁移、侵袭中具有重要作用。与食管癌浸润深度、分化程度及淋巴结转移有关。2、MCM7高表达的胸段食管鳞癌患者预后较差,其更容易出现术后早期复发,且总生存时间较短。3、Ki-67、Podoplanin和MCM7可作为食管癌的潜在预后标志物和肿瘤治疗靶点。