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母源因子是卵母细胞在成熟过程中积累的mRNA和蛋白质。其对于调控卵母细胞的成熟和胚胎的早期发育十分重要。在斑马鱼中,有超过一半的基因都有母源表达。斑马鱼的合子基因组激活起始于一千细胞期（受精后3小时）,在这之前的所有发育过程完全由母源因子调控。即使合子基因组激活后,母源因子仍然会发挥作用,调控胚胎的下包,集中延伸运动,背腹轴的形成等。因此要想阐明一个存在母源表达的基因的功能,需要同时清除其母源和合子产物。基因的母源产物是在减数第一次分裂的双线期产生并积累的,此时同源染色体没有分离,因此只有纯合突变的雌性个体的后代才是母源突变体。一般情况下,通过遗传学的手段获得可活可育的纯合突变体是获得母源突变体的必要条件。但是传统的遗传学方法是通过一代代交配筛选获得纯合突变体的,这样不仅耗费时间（3代鱼,9个月）,而且很多基因的纯合突变体不能存活或者不育。这给获得靶基因的母源突变体设置了障碍。目前,有多种方法试图绕开这一障碍,如注射mRNA拯救、生殖细胞替换手术、卵母细胞显微注射、镶嵌突变策略、BACK策略等。这些方法虽然都创新性地丰富了我们获得靶基因母源突变体的手段,但是它们或者效率低、耗时长,或者技术难度大,因此急需建立一种更加快速直接的方法来获取母源突变体。CRISPR-Cas9系统已经成为基因编辑领域广泛使用的一个强大工具,促进了很多生物学领域的研究。而基于CRISPR-Cas9的条件性敲除已经在多个物种中得到验证。其通常采用的策略是转基因特定启动子驱动的Cas9,从而实现时空特异性的靶基因敲除。然而,目前在斑马鱼中应用Cas9进行条件性敲除的报道并不是很多,其原因可能是效率不稳定导致的镶嵌现象。在大部分组织中所有细胞是作为一个整体在发挥作用,Cas9与sgRNA效率不稳定的结果是只有部分细胞完成了双等位基因的敲除,于是组织中的野生型或者杂合细胞可以对纯合突变细胞进行功能上的补偿,这样的动物模型就不会有明显的表型。但是卵母细胞与其他组织不同,进入双线期后相对独立,互相并不会进行功能上的补偿,一旦突变就会导致母源突变胚胎的产生。因此,在卵母细胞中利用Cas9进行条件性敲除仍然具有高度的可行性。利用这个思路我们开发了卵母细胞特异性条件敲除技术用于获得斑马鱼母源突变体。实现这一技术需要在卵母细胞中同时转基因表达Cas9和sgRNA。我们首先构建并验证了可以在卵母细胞中特异性高表达Cas9的转基因品系Tg（zpc:zcas9）。随后我们将高效的靶基因sgRNA序列连入U6启动子后面,并加上泛表达GFP的序列方便后期的筛选。最后利用I-Sce I转基因技术将构建好的sgRNA表达质粒插入Tg（zpc:zcas9）胚胎基因组中。挑选GFP表达广泛且强烈的胚胎饲养至性成熟。在这些F0雌鱼中,部分卵母细胞会同时表达Cas9和sgRNA,对靶基因进行母源敲除,产生母源突变体。我们首先对这一技术进行初步验证,通过向Tg（zpc:zcas9）品系中转基因表达单个nanogsgRNA,我们成功筛选出2个F0能够产下nanog母源突变体。nanog母源突变体的比例平均约占所有表达GFP胚胎的16.5%。接着我们将nanog sgRNA表达模块的数目增加到3个,进一步地将获得母源突变体平均效率提高到了 38.8%。通过检测,我们发现nanog的母源mRNA和蛋白明显缺失,下游靶基因的表达量明显下降且表达图式出现异常。不仅如此,我们发现向突变体中注射野生型nanog mRNA能显著地拯救其表型,这些结果均验证了我们得到的nanog母源突变体。为了能更准确地鉴定和研究母源突变体,我们建立了一套能同时检测胚胎表型和母源mRNA的方法。利用该方法我们不仅鉴定出了nanog母源突变体的母源mRNA突变形式,而且将这些突变形式与nanog母源突变体的表型一一对应了起来。在这过程中,我们发现卵母细胞中多个Cas9 RNP作用倾向于产生大片段删除。这些删除形式中不仅包含sgRNA位点间的删除,甚至还出现了两端越过sgRNA位点的删除,这一现象在斑马鱼中鲜有报道,但是与哺乳动物早期胚胎和胚胎干细胞中进行基因编辑所出现的“在靶效应”（On Target Effect,OnTE）有一定的相似性。为了进一步验证卵母细胞特异性条件敲除技术的可行性以及多个Cas9 RNP在卵母细胞中倾向于产生大片段删除的现象,我们利用3个不同sgRNA表达模块构建了ctnnb2的母源突变体。相似地,我们通过检测下游靶基因的表达以及回补野生型ctnnb2 mRNA验证了得到的ctnnb2母源突变体。同样地,我们发现了与nanog母源突变体类似的大片段删除现象。那么这一现象是卵母细胞独有的吗?为了作出比较,我们用同样的sgRNA组合与高浓度的Cas9蛋白进行常规的体细胞编辑。经过基因型鉴定与统计,我们发现对于nanog和ctnnb2基因座,常规方法构建的突变体中产生大片段删除的比例远远低于卵母细胞特异性条件敲除产生的母源突变体,而且其中没有发现超越sgRNA位点的删除形式。可见,卵母细胞中多个Cas9 RNP产生大片段删除的倾向性高于体细胞。进一步地,我们还证明了卵母细胞中产生的大片段删除形式的突变可以遗传。Rbm24a是一个保守的RNA结合蛋白,它在不同的物种中的表达图式高度一致,均表达在晶状体,心脏,体节以及耳泡等组织。Rbm24a的斑马鱼或者小鼠突变体中的研究表明,缺失Rbm24a会导致其表达位置的组织发育异常。可见rbm24a在不同发育过程的重要性。通过对转录组数据进行分析,我们发现rbm24a有明显的母源表达,因此我们想研究其母源产物的功能。利用卵母细胞特异性条件敲除技术,我们成功获得并验证了rbm24a母源突变体。从外观上观察,rbm24a母源突变体与野生型没有明显区别,而且rbm24a母源合子突变体与合子突变体也没有明显区别。这表明rbm24a的母源产物对于斑马鱼胚胎的早期形态发生不是必需的。但是需要注意的是,我们并不能排除rbm24a的母源产物能够参与到其他我们未检测的发育过程中。在斑马鱼中,很多同源基因的功能都能互相补偿,因此想要研究某个基因的功能需要同时敲除其同源基因。获得双基因母源突变体对于研究同源基因的母源产物功能是必需的。传统的交配筛选方法至少需要消耗5代鱼（15个月）的时间,而且双基因的合子突变体的致死率要比单基因更高。这些都是研究同源基因母源产物功能的障碍。那么利用卵母细胞特异性条件敲除技术能获得双基因母源突变体吗?我们选择dvl2与dvl3a这两个基因进行验证。这两个基因的母源产物能够互相补偿地参与到斑马鱼胚胎的前后轴的形成以及集中延伸运动过程。经过构建与验证,我们仅花了3个月就获得了dvl2与dvl3a的双基因母源突变体,并同样地在胚胎中检测到了大片段删除。这展现了卵母细胞特异性条件敲除技术在同源基因母源产物功能研究中的巨大潜力。总而言之,我们建立并验证了一种通过在卵母细胞中转基因表达Cas9和sgRNA从而快速获得斑马鱼母源突变体的技术。利用该技术可以克服合子突变体致死或者不育的阻碍获得单基因或者双基因的母源突变体。该技术倾向于产生基因组大片段删除而且具有易操作耗时短的特点。因此我们可以将它应用于母源因子的功能筛选,同源基因母源功能的研究以及产生基因组大片段删除等。