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第一部分lncRNA-Gbla在慢性社会挫败应激所致小鼠抑郁样行为中的作用
目的：抑郁症是最常见的神经精神疾病之一，其病理机制复杂多样。应激导致的一系列基因表达变化在其病理进程中发挥重要作用，已有研究表明表观遗传在应激应答中扮演重要角色，介导广泛的基因表达网络调控。长链非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)参与多种表观遗传学调控进程，但其在抑郁症中的作用尚不清楚。本实验通过建立慢性社会挫败应激(chronic social defeat stress，CSDS)所致的小鼠抑郁症模型，结合基因芯片分析筛选并验证模型小鼠前额叶皮层(medial prefrontal cortex，mPFC)中差异性表达lncRNAs及其在抑郁样行为中的作用。
方法：通过CSDS诱导建立C57BL/6J小鼠抑郁症模型，检测社会接触(social interaction， SI)和糖水偏好(sucrose preference test，SPT)行为学，酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清皮质酮浓度；分取模型小鼠mPFC脑区样本，利用小鼠lncRNA芯片mouselncRNAmicroassay筛选出差异性表达lncRNAs。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)验证模型小鼠mPFC脑区差异性表达的lncRNAs情况。利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization， FISH)检测lncRNA亚细胞定位。通过慢病毒(lentivirus，LV)载体下调lncRNA-Gbla表达，观察其对抑郁样行为的调控和应激导致神经元微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic currents，mEPSCs)损伤的影响。通过腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体调控lncRNA表达，观察其对暴露于阈下应激小鼠易感性和mEPSCs的影响。
结果：(1)根据社会接触、糖水偏好和皮质酮水平将经历CSDS的C57BL/6J小鼠分为应激敏感组和抵抗组。与对照组小鼠相比，敏感组小鼠社会接触时间显著减少，社会接触比率下调(n=15，P<0.001vscontrol)，抵抗组小鼠社会接触时间和比率与对照组相比无明显差异；在糖水偏好行为学检测中，敏感组小鼠糖水偏好比率显著低于对照组和抵抗组小鼠(n=15，P<0.001vscontrolorresilient)。血清皮质酮检测显示敏感组小鼠血清皮质酮水平显著增加(n=7，P<0.01vscontrol)，而抵抗组小鼠无明显变化。(2)小鼠lncRNA芯片数据分析显示，从约35,923条小鼠lncRNAs中检测出1,752条表达有差异性的lncRNAs，与对照组相比，应激敏感组小鼠mPFC中表达上升的lncRNA有614条，表达降低的lncRNA有1,138条。(3)qPCR检测发现敏感组小鼠mPFC区lncRNA-Gbla表达水平显著上调(n=20，P<0.01vscontrol)，抵抗组小鼠与对照组相比无明显改变(n=15)，且mPFC脑区lncRNA-Gbla表达水平与社会接触比率呈显著负相关(Pearson’s，r=-0.322，P<0.05)。(4)mPFC区注射LV-shRNA-Gbla降低lncRNA-Gbla的表达，可改善CSDS诱导的抑郁样行为，显著增加社会接触时间(n=10，P<0.01vsLV-GFP)，与对照组小鼠相比无明显差异。脑片膜片钳实验结果发现，CSDS显著降低敏感组小鼠mEPSC频率和幅度，LV-shRNA-Gbla可逆转该变化。(5)mPFC脑区注射AAV-Gbla增加lncRNA-Gbla表达不影响小鼠在社会接触和糖水偏好行为学，但给予阈下应激暴露后，AAV-Gbla组小鼠出现明显社交逃避(n=14，P<0.01vsAAV-GFP)和糖水偏好比率(n=15，P<0.001vsAAV-GFP)下降。脑片膜片钳实验结果表明，给予阈下应激后，AAV-Gbla可使mPFC脑区mEPSC频率(n=8，P<0.05vsAAV-GFP)和幅度(n=8，P<0.01vsAAV-GFP)显著下降，但不影响正常小鼠的突触传递。
结论：CSDS敏感组小鼠mPFC脑区lncRNA-Gbla表达显著上调，mPFC脑区特异性沉默lncRNA-Gbla逆转CSDS导致的突触功能损伤，改善抑郁样行为。过表达lncRNA-Gbla增加小鼠对应激的易感性，并易化阈下应激所致小鼠突触功能损伤。
第二部分lncRNA-Gbla介导慢性社会挫败应激所致小鼠抑郁样行为的机制
目的：第一部分结果表明CSDS敏感组小鼠mPFC脑区中lncRNA-Gbla表达水平显著上升，mPFC脑区特异性调控lncRNA-Gbla表达可调节小鼠抑郁样行为，本部分实验将进一步深入探讨lncRNA-Gbla介导小鼠抑郁样行为的机制。
方法：通过RNApull-down实验，联合质谱分析寻找与lncRNA-Gbla直接相互作用蛋白。利用FISH确定lncRNA-Gbla相关蛋白的亚细胞定位；通过RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation，RIP)确定lncRNA-Gbla及其相关蛋白的相互作用。针对预测的蛋白编码序列结合片段构建重组蛋白，确定lncRNA-Gbla与相关蛋白的结合区域。通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)实验确定lncRNA-Gbla与相应蛋白的空间构象关系。在培养神经元调控GRP78表达观察其对未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)活性和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionicacidreceptor，AMPAR)膜表达的影响。mPFC脑区注射LV-shRNA-Gbla观察其对AMPAR膜表达水平的作用。采用AAV过表达葡萄糖调节蛋白78(78 kDa glucose-regulated protein，GRP78)，观察其对小鼠抑郁样行为和突触传递的影响。采用LV-shRNA-GRP78下调GRP78表达，结合阈下应激观察小鼠抑郁样行为和突触传递的变化。
结果：(1)RNApull-down和质谱结果表明若干蛋白与lncRNA-Gbla形成复合体，包括热休克蛋白90β(heatshockprotein90-beta，HSP90β)、延伸蛋白2(Elongation 2，ELO2)、热休克蛋白90α(Heatshockprotein90-alpha，HSP90α)和葡萄糖调节蛋白78(78 kDa glucose-regulated protein，GRP78)。生物信息学分析及验证后选择GRP78作为lncRNA-Gbla下游机制进行研究。(2)荧光原位杂交结果表明lncRNA-Gbla和GRP78的荧光在细胞胞浆中重合，且未与细胞核标记物DAPI发生融合，表明二者在胞浆中存在细胞共定位。(3)RIP实验中，预先将GRP78抗体与相应磁珠交联，通过抗原抗体结合反应募集GRP78，qPCR检测相应的RNA提取物发现GRP78抗体交联所沉淀RNA中lncRNA-Gbla水平显著高于IgG对照组(n=4，P<0.001vsIgG)，表明lncRNA-Gbla与GRP78存在特异性结合。(4)根据GRP78蛋白编码序列和lncRNA-Gbla序列进行对比分析，得出三个可能的结合片段，针对这些片段构建重组蛋白，RIP实验结果显示，除第二个片段重组蛋白GRP78δ2不能有效沉淀lncRNA-Gbla外(n=3，P=0.3481vsIgG)，GRP78全长(n=3，P<0.01vsIgG)，GRP78δ1(n=3，P<0.05vsIgG)和GRP78δ3(n=2，P<0.01vsIgG)均能有效沉淀lncRNA-Gbla，提示lncRNA-Gbla与GRP78结合区域位于GRP78蛋白编码序列的第一个和第三个片段中。(5)FRET实验结果发现，激发lncRNA-Gbla荧光能有效诱导GRP78荧光分子产生能量共振转移，提示lncRNA-Gbla与GRP78间存在直接结合。(6)Westernblotting结果显示给予衣霉素(tunicamycin，TM)可显著上调培养皮层神经元GRP78蛋白、p-IRE-1、ATF6和XBP-1蛋白表达水平(n=6，P<0.05or0.01vsvehicle)，但不影响IRE-1(n=6)和Caspase12(n=3)蛋白表达水平，提示增加GRP78蛋白水平可上调UPR活性。进一步检测AMPAR膜蛋白表达水平，发现TM给药显著增加GluA1和GluA2膜蛋白表达水平(s-GluA1：n=6，P<0.01；s-GluA2：n=9，P<0.01vsvehicle)，不影响GluA1和GluA2总蛋白表达水平。CSDS显著下调敏感组小鼠mPFC脑区GluA1和GluA2膜蛋白表达水平(s-GluA1：n=6，P<0.05vscontrol；s-GluA2：n=6，P<0.01vscontrol)，但不影响GluA1和GluA2总蛋白表达水平。在整体动物水平，相比于LV-GFP组，mPFC脑区注射LV-shRNA-Gbla逆转CSDS所致AMPAR膜蛋白表达变化，显著上调模型组小鼠GluA1(n=6，P<0.05vsLV-GFP)和GluA2(n=6，P<0.01vsLV-GFP)膜蛋白表达水平。(7)Westernblotting结果显示敏感组小鼠mPFC脑区GRP78蛋白水平显著下调(n=6，P<0.05vscontrol)。mPFC脑区注射AAV-GRP78使GRP78过表达可逆转CSDS导致的社会逃避行为和糖水偏好比率下降(n=9-10，P<0.01vsAAV-GFP)。脑片膜片钳记录结果表明，AAV-GRP78增加模型组小鼠mPFC脑区mEPSC频率和幅度(n=8，P<0.01vsAAV-GFP)。(8)mPFC脑区注射LV-shRNA-GRP78显著下调GRP78表达水平(n=3，P<0.05vsLV-GFP)，并导致阈下应激后小鼠出现社交逃避行为(n=11，P<0.05vsLV-GFP)和糖水偏好比率下降(n=13，P<0.001vsLV-GFP)，但不能直接调控小鼠社会接触和糖水偏好行为。此外，脑区注射LV-shRNA-GRP78导致小鼠经历阈下应激后mPFC脑区mEPSC频率(n=8，P<0.05vsLV-GFP)和幅度(n=8，P<0.01vsLV-GFP)显著下降。
结论：上调mPFC区lncRNA-Gbla增加使GRP78蛋白表达降低，抑制UPR活性，减少AMPAR膜表达，损伤突触传递，增加小鼠对应激易感性，易化应激后抑郁样行为的产生。
目的：抑郁症是最常见的神经精神疾病之一，其病理机制复杂多样。应激导致的一系列基因表达变化在其病理进程中发挥重要作用，已有研究表明表观遗传在应激应答中扮演重要角色，介导广泛的基因表达网络调控。长链非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)参与多种表观遗传学调控进程，但其在抑郁症中的作用尚不清楚。本实验通过建立慢性社会挫败应激(chronic social defeat stress，CSDS)所致的小鼠抑郁症模型，结合基因芯片分析筛选并验证模型小鼠前额叶皮层(medial prefrontal cortex，mPFC)中差异性表达lncRNAs及其在抑郁样行为中的作用。
方法：通过CSDS诱导建立C57BL/6J小鼠抑郁症模型，检测社会接触(social interaction， SI)和糖水偏好(sucrose preference test，SPT)行为学，酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清皮质酮浓度；分取模型小鼠mPFC脑区样本，利用小鼠lncRNA芯片mouselncRNAmicroassay筛选出差异性表达lncRNAs。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)验证模型小鼠mPFC脑区差异性表达的lncRNAs情况。利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization， FISH)检测lncRNA亚细胞定位。通过慢病毒(lentivirus，LV)载体下调lncRNA-Gbla表达，观察其对抑郁样行为的调控和应激导致神经元微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic currents，mEPSCs)损伤的影响。通过腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体调控lncRNA表达，观察其对暴露于阈下应激小鼠易感性和mEPSCs的影响。
结果：(1)根据社会接触、糖水偏好和皮质酮水平将经历CSDS的C57BL/6J小鼠分为应激敏感组和抵抗组。与对照组小鼠相比，敏感组小鼠社会接触时间显著减少，社会接触比率下调(n=15，P<0.001vscontrol)，抵抗组小鼠社会接触时间和比率与对照组相比无明显差异；在糖水偏好行为学检测中，敏感组小鼠糖水偏好比率显著低于对照组和抵抗组小鼠(n=15，P<0.001vscontrolorresilient)。血清皮质酮检测显示敏感组小鼠血清皮质酮水平显著增加(n=7，P<0.01vscontrol)，而抵抗组小鼠无明显变化。(2)小鼠lncRNA芯片数据分析显示，从约35,923条小鼠lncRNAs中检测出1,752条表达有差异性的lncRNAs，与对照组相比，应激敏感组小鼠mPFC中表达上升的lncRNA有614条，表达降低的lncRNA有1,138条。(3)qPCR检测发现敏感组小鼠mPFC区lncRNA-Gbla表达水平显著上调(n=20，P<0.01vscontrol)，抵抗组小鼠与对照组相比无明显改变(n=15)，且mPFC脑区lncRNA-Gbla表达水平与社会接触比率呈显著负相关(Pearson’s，r=-0.322，P<0.05)。(4)mPFC区注射LV-shRNA-Gbla降低lncRNA-Gbla的表达，可改善CSDS诱导的抑郁样行为，显著增加社会接触时间(n=10，P<0.01vsLV-GFP)，与对照组小鼠相比无明显差异。脑片膜片钳实验结果发现，CSDS显著降低敏感组小鼠mEPSC频率和幅度，LV-shRNA-Gbla可逆转该变化。(5)mPFC脑区注射AAV-Gbla增加lncRNA-Gbla表达不影响小鼠在社会接触和糖水偏好行为学，但给予阈下应激暴露后，AAV-Gbla组小鼠出现明显社交逃避(n=14，P<0.01vsAAV-GFP)和糖水偏好比率(n=15，P<0.001vsAAV-GFP)下降。脑片膜片钳实验结果表明，给予阈下应激后，AAV-Gbla可使mPFC脑区mEPSC频率(n=8，P<0.05vsAAV-GFP)和幅度(n=8，P<0.01vsAAV-GFP)显著下降，但不影响正常小鼠的突触传递。
结论：CSDS敏感组小鼠mPFC脑区lncRNA-Gbla表达显著上调，mPFC脑区特异性沉默lncRNA-Gbla逆转CSDS导致的突触功能损伤，改善抑郁样行为。过表达lncRNA-Gbla增加小鼠对应激的易感性，并易化阈下应激所致小鼠突触功能损伤。
第二部分lncRNA-Gbla介导慢性社会挫败应激所致小鼠抑郁样行为的机制
目的：第一部分结果表明CSDS敏感组小鼠mPFC脑区中lncRNA-Gbla表达水平显著上升，mPFC脑区特异性调控lncRNA-Gbla表达可调节小鼠抑郁样行为，本部分实验将进一步深入探讨lncRNA-Gbla介导小鼠抑郁样行为的机制。
方法：通过RNApull-down实验，联合质谱分析寻找与lncRNA-Gbla直接相互作用蛋白。利用FISH确定lncRNA-Gbla相关蛋白的亚细胞定位；通过RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation，RIP)确定lncRNA-Gbla及其相关蛋白的相互作用。针对预测的蛋白编码序列结合片段构建重组蛋白，确定lncRNA-Gbla与相关蛋白的结合区域。通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)实验确定lncRNA-Gbla与相应蛋白的空间构象关系。在培养神经元调控GRP78表达观察其对未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)活性和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionicacidreceptor，AMPAR)膜表达的影响。mPFC脑区注射LV-shRNA-Gbla观察其对AMPAR膜表达水平的作用。采用AAV过表达葡萄糖调节蛋白78(78 kDa glucose-regulated protein，GRP78)，观察其对小鼠抑郁样行为和突触传递的影响。采用LV-shRNA-GRP78下调GRP78表达，结合阈下应激观察小鼠抑郁样行为和突触传递的变化。
结果：(1)RNApull-down和质谱结果表明若干蛋白与lncRNA-Gbla形成复合体，包括热休克蛋白90β(heatshockprotein90-beta，HSP90β)、延伸蛋白2(Elongation 2，ELO2)、热休克蛋白90α(Heatshockprotein90-alpha，HSP90α)和葡萄糖调节蛋白78(78 kDa glucose-regulated protein，GRP78)。生物信息学分析及验证后选择GRP78作为lncRNA-Gbla下游机制进行研究。(2)荧光原位杂交结果表明lncRNA-Gbla和GRP78的荧光在细胞胞浆中重合，且未与细胞核标记物DAPI发生融合，表明二者在胞浆中存在细胞共定位。(3)RIP实验中，预先将GRP78抗体与相应磁珠交联，通过抗原抗体结合反应募集GRP78，qPCR检测相应的RNA提取物发现GRP78抗体交联所沉淀RNA中lncRNA-Gbla水平显著高于IgG对照组(n=4，P<0.001vsIgG)，表明lncRNA-Gbla与GRP78存在特异性结合。(4)根据GRP78蛋白编码序列和lncRNA-Gbla序列进行对比分析，得出三个可能的结合片段，针对这些片段构建重组蛋白，RIP实验结果显示，除第二个片段重组蛋白GRP78δ2不能有效沉淀lncRNA-Gbla外(n=3，P=0.3481vsIgG)，GRP78全长(n=3，P<0.01vsIgG)，GRP78δ1(n=3，P<0.05vsIgG)和GRP78δ3(n=2，P<0.01vsIgG)均能有效沉淀lncRNA-Gbla，提示lncRNA-Gbla与GRP78结合区域位于GRP78蛋白编码序列的第一个和第三个片段中。(5)FRET实验结果发现，激发lncRNA-Gbla荧光能有效诱导GRP78荧光分子产生能量共振转移，提示lncRNA-Gbla与GRP78间存在直接结合。(6)Westernblotting结果显示给予衣霉素(tunicamycin，TM)可显著上调培养皮层神经元GRP78蛋白、p-IRE-1、ATF6和XBP-1蛋白表达水平(n=6，P<0.05or0.01vsvehicle)，但不影响IRE-1(n=6)和Caspase12(n=3)蛋白表达水平，提示增加GRP78蛋白水平可上调UPR活性。进一步检测AMPAR膜蛋白表达水平，发现TM给药显著增加GluA1和GluA2膜蛋白表达水平(s-GluA1：n=6，P<0.01；s-GluA2：n=9，P<0.01vsvehicle)，不影响GluA1和GluA2总蛋白表达水平。CSDS显著下调敏感组小鼠mPFC脑区GluA1和GluA2膜蛋白表达水平(s-GluA1：n=6，P<0.05vscontrol；s-GluA2：n=6，P<0.01vscontrol)，但不影响GluA1和GluA2总蛋白表达水平。在整体动物水平，相比于LV-GFP组，mPFC脑区注射LV-shRNA-Gbla逆转CSDS所致AMPAR膜蛋白表达变化，显著上调模型组小鼠GluA1(n=6，P<0.05vsLV-GFP)和GluA2(n=6，P<0.01vsLV-GFP)膜蛋白表达水平。(7)Westernblotting结果显示敏感组小鼠mPFC脑区GRP78蛋白水平显著下调(n=6，P<0.05vscontrol)。mPFC脑区注射AAV-GRP78使GRP78过表达可逆转CSDS导致的社会逃避行为和糖水偏好比率下降(n=9-10，P<0.01vsAAV-GFP)。脑片膜片钳记录结果表明，AAV-GRP78增加模型组小鼠mPFC脑区mEPSC频率和幅度(n=8，P<0.01vsAAV-GFP)。(8)mPFC脑区注射LV-shRNA-GRP78显著下调GRP78表达水平(n=3，P<0.05vsLV-GFP)，并导致阈下应激后小鼠出现社交逃避行为(n=11，P<0.05vsLV-GFP)和糖水偏好比率下降(n=13，P<0.001vsLV-GFP)，但不能直接调控小鼠社会接触和糖水偏好行为。此外，脑区注射LV-shRNA-GRP78导致小鼠经历阈下应激后mPFC脑区mEPSC频率(n=8，P<0.05vsLV-GFP)和幅度(n=8，P<0.01vsLV-GFP)显著下降。
结论：上调mPFC区lncRNA-Gbla增加使GRP78蛋白表达降低，抑制UPR活性，减少AMPAR膜表达，损伤突触传递，增加小鼠对应激易感性，易化应激后抑郁样行为的产生。