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目的：
PID1(Phosphotyrosine interaction domain 1)，即磷酸酪氨酸互作结构域蛋白1是含有简单磷酸酪氨酸结合结构域(PTB)的蛋白，为2006年通过抑制消减杂交(SSH, suppression subtractive hybridization)技术从肥胖人群腹膜后脂肪组织中鉴定的差异基因，与肥胖相关代谢性疾病，如胰岛素抵抗和2型糖尿病密切相关。我们前期研究证实PID1可诱导肝癌的发生，且诱导免疫抑制性细胞MDSCs的肝脏聚集。因此，本文旨在探究PID1诱发肝癌的具体机制及其与肥胖之间的关系，同时进一步阐明PID1诱导免疫抑制的作用机制。
方法：
(1)采用人源肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721以PID1质粒转染过表达PID1,qPCR技术检测PID1表达情况，MTT法及克隆形成法检测PID1体外促肝癌细胞增殖情况，琼脂凝胶成球实验检测PID1非贴壁依赖性促肝癌细胞增殖及成瘤能力，划痕实验评价PID1对肝癌细胞的促转移能力。采用C57BL/6J小鼠以流体力学高压尾静脉注射方法(Hydrodynamic Injection)构建肝脏特异性过表达PID1的模型，同时给予高脂饮食(HFD)饮食干预，以正常饮食(NCD)为对照；肝脏成瘤照片及免疫组化Ki-67染色确定PID1的促肿瘤作用，实验过程中体重监测评估PID1对体重的影响，肝脏切片苏木素和伊红染色(hematoxylin and eosin, H&E)观察小鼠肝脏的病理情况，油红O(oil red O, ORO)染色观察小鼠肝脏脂肪病变情况，肝体重比及脂肪体重比进一步观察PID1对肝脏和脂肪的影响；生化试剂盒检测小鼠血清中总甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)及游离脂肪酸(NEFA)的含量评估PID1对小鼠血脂的影响，生化试剂盒检测小鼠肝脏组织TG、TC和NEFA的含量评估PID1对小鼠肝脏脂质蓄积的作用；血糖仪检测实验过程中小鼠空腹血糖(FBG)的变化，口服糖耐量实验(OGTT)检测PID1促肝癌过程中对小鼠血糖调节能力的影响。
(2)利用TALEN(transcription activator-like effector nuclease)技术剪切目标基因PID1的编码区，通过NHEJ修复及移码突变，使得PID1蛋白失活实现PID1基因敲除，构建PID1全身性敲除小鼠(PID1-Knockout ， PID1-KO)。基因测序筛选PID1杂合子(PID1+/-)小鼠，对(PID1+/-)小鼠雌雄之间或者与野生型(WT)小鼠进行交配繁殖至F3代，获得一定数量PID1敲除(PID1-/-)小鼠。qPCR技术检测(PID1-/-)小鼠7种主要组织，即肝脏、骨骼肌、脂肪、脾脏、淋巴结、胸腺及胰腺的PID1表达情况。观察统计各基因型小鼠的生殖能力及体重变化情况。
(3)利用免疫共沉淀(Co-IP)于体外确定PID1与磷酸化EGFR的结合，采用GEPIA软件分析TCGA数据库中肝癌患者PID1与EGFR表达的皮尔逊相关系数，采用免疫荧光技术确定PID1与EGFR-pY1148及EGFR-pY1173蛋白的共定位。采用抗CD8抗体、抗Gr-1抗体及ARG1抑制剂对CD8+T细胞及MDSCs进行封闭，确认PID1通过诱导MDSCs聚集诱导免疫抑制；H&E染色及Ki-67和CD68免疫组化染色观察肝脏组织变化及增殖和炎性聚集情况。qPCR技术分析肝脏糖脂代谢基因表达谱，确定PID1对肝脏代谢的影响；采用慢病毒敲低小鼠肝癌细胞株Hepa1-6中PID1表达体外探究PID1对糖酵解的作用，体外采用油酸(OA)刺激原代MDSCs，流式细胞术检测MDSCs表面抗原Ly6G、Ly6C、F4/80表达百分比，qPCR技术检测MDSCs中PID1、FABP4及PPARγ基因表达，确定高脂环境对MDSCs的影响。采用小鼠成纤维细胞系MEF细胞，体外质粒转染高表达PID1，qPCR技术检测表面抗原α-SAM、FAP、PDPN、PDGFR-α、PDGFR-β、ICAM-1、VCAM-1，细胞因子IL-6、IL-7、IL-22、BAFF，表面受体IL-22R1、TNFRSF1α、TNFRSF1β、LTβR以及趋化因子CCL19、CXCL13的表达，流式细胞术检测PID1高表达MEF细胞的DC表面标志分子CD11C、MHC-II、PD-L1和CD86的表达情况。
结果：
(1)体外研究结果表明，PID1的高表达可显著促进肝癌细胞的增殖。此外，无论是贴壁依赖性还是非贴壁依赖性克隆增殖结果均表明PID1具有较明显的促癌基因特性，可促进肿瘤细胞的成瘤活性，PID1高表达还可显著增强肿瘤细胞的迁移能力。体内研究结果表明，PID1的肝脏高表达可诱导肿瘤的形成且与饮食无关，PID1高表达与Ki-67表达呈正相关，HFD饮食可加重这一进程。PID1的肝脏高表达对体重无显著影响，PID1单纯高表达即可促进肝脏脂肪变性，HFD的饮食干预可加重这一过程，PID1单独过表达可显著升高血清LDL-C水平，HFD对血清TC的影响较为明显，且16周血清脂质变化较为显著，PID1高表达还可显著诱导肝脏部位NEFA的累积。PID1的单纯过表达对小鼠空腹血糖无显著影响。
(2)PID1敲除小鼠的多器官PID1表达均降低，但是脂肪和肌肉组织的PID1表达较肝脏的表达低。此外，我们还发现PID1基因的缺乏显著影响小鼠的正常繁殖，且无论杂合子敲除还是纯合子敲除小鼠的体重均较野生型小鼠体重低。
(3)PID1与EGFR第1173和1148位点酪氨酸磷酸化残基存在结合，并显示可共定位于胞内。MDSCs的耗竭可显著改善肝脏组织的病变、炎性损伤及增殖，而CD8+T细胞的封闭对这一进程无明显作用。PID1高表达下肝脏的SREBP1及其靶基因ACC1、FASN和SCD1的表达均上调，且PID1高表达组糖酵解过程关键酶编码基因GLUT2、LDHα、ENO1和PKM的表达也显著上调，PID1敲低可显著降低肝癌细胞乳酸生成。脂质环境刺激下，Ly6G+MDSCs的比例显著升高。PID1可激活成纤维细胞产生PDPN+CAFs，PID1表达与ICAM-1和VCAM-1表达呈显著正相关，且PID1高表达组炎症因子IL-6mRNA水平均显著升高，趋化因子CXCL13表达呈现上升趋势，PID1高表达的MEF细胞呈现APC细胞DC的特征，但其共刺激分子CD86表达较低。
结论：
(1)PID1体外高表达可促进肝癌细胞增殖，在小鼠中可直接诱导肝脏肿瘤的形成，并且HFD诱导的肥胖等并发症可加重这一进程。此外，PID1肝脏高表达可诱导肝脏脂肪变性及脂肪酸的累积，但是对体重无显著影响。
(2)PID1基因的敲除，特别是脂肪组织PID1敲低可能显著影响小鼠正常繁育和生长；PID1在不同的组织可能发挥不同的作用，且广泛参与代谢及细胞增殖等相关生理过程。
(3)PID1可结合于EGFR的胞内1173和1148酪氨酸磷酸化位点，从而激活EGFR下游通路促进肝癌细胞增殖；PID1还可通过诱导MDSCs的肝脏聚集促进肝癌发生；PID1可能通过诱导富含脂肪酸及乳酸的微环境促进MDSCs的肝脏募集及免疫抑制微环境；PID1可能激活PDPN+癌症相关成纤维细胞(CAFs)，进一步参与肿瘤细胞的免疫逃逸。
创新点：
本研究首次证实肥胖相关基因PID1在肝癌形成中的重要作用，并从代谢和免疫的角度解释了其潜在的机制，从而为肝癌的临床治疗提供科学依据及新的治疗靶点。
PID1(Phosphotyrosine interaction domain 1)，即磷酸酪氨酸互作结构域蛋白1是含有简单磷酸酪氨酸结合结构域(PTB)的蛋白，为2006年通过抑制消减杂交(SSH, suppression subtractive hybridization)技术从肥胖人群腹膜后脂肪组织中鉴定的差异基因，与肥胖相关代谢性疾病，如胰岛素抵抗和2型糖尿病密切相关。我们前期研究证实PID1可诱导肝癌的发生，且诱导免疫抑制性细胞MDSCs的肝脏聚集。因此，本文旨在探究PID1诱发肝癌的具体机制及其与肥胖之间的关系，同时进一步阐明PID1诱导免疫抑制的作用机制。
方法：
(1)采用人源肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721以PID1质粒转染过表达PID1,qPCR技术检测PID1表达情况，MTT法及克隆形成法检测PID1体外促肝癌细胞增殖情况，琼脂凝胶成球实验检测PID1非贴壁依赖性促肝癌细胞增殖及成瘤能力，划痕实验评价PID1对肝癌细胞的促转移能力。采用C57BL/6J小鼠以流体力学高压尾静脉注射方法(Hydrodynamic Injection)构建肝脏特异性过表达PID1的模型，同时给予高脂饮食(HFD)饮食干预，以正常饮食(NCD)为对照；肝脏成瘤照片及免疫组化Ki-67染色确定PID1的促肿瘤作用，实验过程中体重监测评估PID1对体重的影响，肝脏切片苏木素和伊红染色(hematoxylin and eosin, H&E)观察小鼠肝脏的病理情况，油红O(oil red O, ORO)染色观察小鼠肝脏脂肪病变情况，肝体重比及脂肪体重比进一步观察PID1对肝脏和脂肪的影响；生化试剂盒检测小鼠血清中总甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)及游离脂肪酸(NEFA)的含量评估PID1对小鼠血脂的影响，生化试剂盒检测小鼠肝脏组织TG、TC和NEFA的含量评估PID1对小鼠肝脏脂质蓄积的作用；血糖仪检测实验过程中小鼠空腹血糖(FBG)的变化，口服糖耐量实验(OGTT)检测PID1促肝癌过程中对小鼠血糖调节能力的影响。
(2)利用TALEN(transcription activator-like effector nuclease)技术剪切目标基因PID1的编码区，通过NHEJ修复及移码突变，使得PID1蛋白失活实现PID1基因敲除，构建PID1全身性敲除小鼠(PID1-Knockout ， PID1-KO)。基因测序筛选PID1杂合子(PID1+/-)小鼠，对(PID1+/-)小鼠雌雄之间或者与野生型(WT)小鼠进行交配繁殖至F3代，获得一定数量PID1敲除(PID1-/-)小鼠。qPCR技术检测(PID1-/-)小鼠7种主要组织，即肝脏、骨骼肌、脂肪、脾脏、淋巴结、胸腺及胰腺的PID1表达情况。观察统计各基因型小鼠的生殖能力及体重变化情况。
(3)利用免疫共沉淀(Co-IP)于体外确定PID1与磷酸化EGFR的结合，采用GEPIA软件分析TCGA数据库中肝癌患者PID1与EGFR表达的皮尔逊相关系数，采用免疫荧光技术确定PID1与EGFR-pY1148及EGFR-pY1173蛋白的共定位。采用抗CD8抗体、抗Gr-1抗体及ARG1抑制剂对CD8+T细胞及MDSCs进行封闭，确认PID1通过诱导MDSCs聚集诱导免疫抑制；H&E染色及Ki-67和CD68免疫组化染色观察肝脏组织变化及增殖和炎性聚集情况。qPCR技术分析肝脏糖脂代谢基因表达谱，确定PID1对肝脏代谢的影响；采用慢病毒敲低小鼠肝癌细胞株Hepa1-6中PID1表达体外探究PID1对糖酵解的作用，体外采用油酸(OA)刺激原代MDSCs，流式细胞术检测MDSCs表面抗原Ly6G、Ly6C、F4/80表达百分比，qPCR技术检测MDSCs中PID1、FABP4及PPARγ基因表达，确定高脂环境对MDSCs的影响。采用小鼠成纤维细胞系MEF细胞，体外质粒转染高表达PID1，qPCR技术检测表面抗原α-SAM、FAP、PDPN、PDGFR-α、PDGFR-β、ICAM-1、VCAM-1，细胞因子IL-6、IL-7、IL-22、BAFF，表面受体IL-22R1、TNFRSF1α、TNFRSF1β、LTβR以及趋化因子CCL19、CXCL13的表达，流式细胞术检测PID1高表达MEF细胞的DC表面标志分子CD11C、MHC-II、PD-L1和CD86的表达情况。
结果：
(1)体外研究结果表明，PID1的高表达可显著促进肝癌细胞的增殖。此外，无论是贴壁依赖性还是非贴壁依赖性克隆增殖结果均表明PID1具有较明显的促癌基因特性，可促进肿瘤细胞的成瘤活性，PID1高表达还可显著增强肿瘤细胞的迁移能力。体内研究结果表明，PID1的肝脏高表达可诱导肿瘤的形成且与饮食无关，PID1高表达与Ki-67表达呈正相关，HFD饮食可加重这一进程。PID1的肝脏高表达对体重无显著影响，PID1单纯高表达即可促进肝脏脂肪变性，HFD的饮食干预可加重这一过程，PID1单独过表达可显著升高血清LDL-C水平，HFD对血清TC的影响较为明显，且16周血清脂质变化较为显著，PID1高表达还可显著诱导肝脏部位NEFA的累积。PID1的单纯过表达对小鼠空腹血糖无显著影响。
(2)PID1敲除小鼠的多器官PID1表达均降低，但是脂肪和肌肉组织的PID1表达较肝脏的表达低。此外，我们还发现PID1基因的缺乏显著影响小鼠的正常繁殖，且无论杂合子敲除还是纯合子敲除小鼠的体重均较野生型小鼠体重低。
(3)PID1与EGFR第1173和1148位点酪氨酸磷酸化残基存在结合，并显示可共定位于胞内。MDSCs的耗竭可显著改善肝脏组织的病变、炎性损伤及增殖，而CD8+T细胞的封闭对这一进程无明显作用。PID1高表达下肝脏的SREBP1及其靶基因ACC1、FASN和SCD1的表达均上调，且PID1高表达组糖酵解过程关键酶编码基因GLUT2、LDHα、ENO1和PKM的表达也显著上调，PID1敲低可显著降低肝癌细胞乳酸生成。脂质环境刺激下，Ly6G+MDSCs的比例显著升高。PID1可激活成纤维细胞产生PDPN+CAFs，PID1表达与ICAM-1和VCAM-1表达呈显著正相关，且PID1高表达组炎症因子IL-6mRNA水平均显著升高，趋化因子CXCL13表达呈现上升趋势，PID1高表达的MEF细胞呈现APC细胞DC的特征，但其共刺激分子CD86表达较低。
结论：
(1)PID1体外高表达可促进肝癌细胞增殖，在小鼠中可直接诱导肝脏肿瘤的形成，并且HFD诱导的肥胖等并发症可加重这一进程。此外，PID1肝脏高表达可诱导肝脏脂肪变性及脂肪酸的累积，但是对体重无显著影响。
(2)PID1基因的敲除，特别是脂肪组织PID1敲低可能显著影响小鼠正常繁育和生长；PID1在不同的组织可能发挥不同的作用，且广泛参与代谢及细胞增殖等相关生理过程。
(3)PID1可结合于EGFR的胞内1173和1148酪氨酸磷酸化位点，从而激活EGFR下游通路促进肝癌细胞增殖；PID1还可通过诱导MDSCs的肝脏聚集促进肝癌发生；PID1可能通过诱导富含脂肪酸及乳酸的微环境促进MDSCs的肝脏募集及免疫抑制微环境；PID1可能激活PDPN+癌症相关成纤维细胞(CAFs)，进一步参与肿瘤细胞的免疫逃逸。
创新点：
本研究首次证实肥胖相关基因PID1在肝癌形成中的重要作用，并从代谢和免疫的角度解释了其潜在的机制，从而为肝癌的临床治疗提供科学依据及新的治疗靶点。