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目的：肝癌是一种恶性程度较高的肿瘤，早期症状不明显且治疗手段相对匮乏，肝癌患者的5年生存率仅为10.1%。化疗耐药是导致肿瘤患者预后不良的重要原因之一，在肝癌治疗中耐药问题十分严峻，为克服耐药，临床上常选用联合给药的策略，通过不同的药理机制杀伤肿瘤细胞。随着纳米技术的发展，具有减毒增效作用的纳米制剂被大量应用于癌症研究。本研究将构建可将顺铂颗粒和基因药物同时递送至肿瘤部位的脂包被磷酸钙纳米粒，一则通过基因药物沉默与顺铂耐药相关的Bmi-1基因，抑制癌细胞增殖；二则利用磷酸钙纳米粒的EPR效应和pH敏感特性提高给药靶向性。
方法：1、耐顺铂HepG2细胞的诱导：用低剂量顺铂培养HepG2细胞，顺铂剂量从低到高加至2μM后，再诱导数周。用WesternBlot实验考察细胞在顺铂诱导后表达Bmi-1的情况，用细胞毒实验考察细胞对化疗药的敏感度。2、构建脂包被顺铂/磷酸钙共载Bmi-1siRNA纳米粒(NPSC)：利用反相微乳法将磷酸钙与药物、DOPA亲水端共沉淀，制备成粒径约20nm的球形内核，再用薄膜分散法包被磷脂DOTAP、胆固醇、DSPE-PEG2000，通过带正电的DOTAP和带负电的DOPA之间的静电作用实现包被。运用透射电子显微镜、原子吸收分光光度计、WesternBlot等方法表征纳米粒子的形态、粒径、药物含量、沉默效率和稳定性等指标。3、载药纳米粒体外、体内作用评价：通过纳米粒荧光标记、细胞毒实验、蛋白质印迹法等方法测定NPSC对癌细胞的给药效率；通过小动物荧光成像、组织内药物浓度检测，考察载体的靶向递送作用；通过建立HepG2小鼠移植瘤模型检验NPSC的抗肿瘤活性和安全性。
结果：HepG2细胞经顺铂诱导数周后，Bmi-1表达升高，癌细胞对顺铂的敏感度下降。在沉默了耐药细胞的Bmi-1基因后，化疗药的抑制率明显上升。NPSC在电镜下观察到的粒径约50nm，且NPSC释放药物有一定的pH响应特性，NPSC中顺铂和Bmi-1siRNA的包封率分别为24.3±5.4%和88.1±3.5%。相比游离药物，脂包被磷酸钙提升了细胞对药物的摄取率，进而提高了对癌细胞生长的抑制作用。WesternBlot实验证明，NPSC能有效地转染Bmi-1siRNA并沉默Bmi-1基因。体内分布及药效评价实验中，纳米载药系统使药物在肿瘤组织中的浓度升高，对肿瘤生长表现出明显的抑制作用；在肾脏中浓度下降，损伤较游离药物少，NPSC对小鼠的安全性良好。
结论：本研究结果证明新型脂包被顺铂/磷酸钙共载Bmi-1siRNA纳米载药系统将化疗药和核酸药物联用能提升癌细胞对化疗药的敏感性。同时，磷酸钙纳米载体提高了游离药物的靶向性，有效地抑制了肿瘤的增殖。这种联合基因药物的靶向给药方式为解决癌症治疗中耐药和副作用的难题提供了思路。
方法：1、耐顺铂HepG2细胞的诱导：用低剂量顺铂培养HepG2细胞，顺铂剂量从低到高加至2μM后，再诱导数周。用WesternBlot实验考察细胞在顺铂诱导后表达Bmi-1的情况，用细胞毒实验考察细胞对化疗药的敏感度。2、构建脂包被顺铂/磷酸钙共载Bmi-1siRNA纳米粒(NPSC)：利用反相微乳法将磷酸钙与药物、DOPA亲水端共沉淀，制备成粒径约20nm的球形内核，再用薄膜分散法包被磷脂DOTAP、胆固醇、DSPE-PEG2000，通过带正电的DOTAP和带负电的DOPA之间的静电作用实现包被。运用透射电子显微镜、原子吸收分光光度计、WesternBlot等方法表征纳米粒子的形态、粒径、药物含量、沉默效率和稳定性等指标。3、载药纳米粒体外、体内作用评价：通过纳米粒荧光标记、细胞毒实验、蛋白质印迹法等方法测定NPSC对癌细胞的给药效率；通过小动物荧光成像、组织内药物浓度检测，考察载体的靶向递送作用；通过建立HepG2小鼠移植瘤模型检验NPSC的抗肿瘤活性和安全性。
结果：HepG2细胞经顺铂诱导数周后，Bmi-1表达升高，癌细胞对顺铂的敏感度下降。在沉默了耐药细胞的Bmi-1基因后，化疗药的抑制率明显上升。NPSC在电镜下观察到的粒径约50nm，且NPSC释放药物有一定的pH响应特性，NPSC中顺铂和Bmi-1siRNA的包封率分别为24.3±5.4%和88.1±3.5%。相比游离药物，脂包被磷酸钙提升了细胞对药物的摄取率，进而提高了对癌细胞生长的抑制作用。WesternBlot实验证明，NPSC能有效地转染Bmi-1siRNA并沉默Bmi-1基因。体内分布及药效评价实验中，纳米载药系统使药物在肿瘤组织中的浓度升高，对肿瘤生长表现出明显的抑制作用；在肾脏中浓度下降，损伤较游离药物少，NPSC对小鼠的安全性良好。
结论：本研究结果证明新型脂包被顺铂/磷酸钙共载Bmi-1siRNA纳米载药系统将化疗药和核酸药物联用能提升癌细胞对化疗药的敏感性。同时，磷酸钙纳米载体提高了游离药物的靶向性，有效地抑制了肿瘤的增殖。这种联合基因药物的靶向给药方式为解决癌症治疗中耐药和副作用的难题提供了思路。