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肥胖增加患癌危险及癌症相关的病死率，其机制有待深入探索。程序性死亡蛋白1(Programmed death protein 1，PD-1)及其配体PD-L1(Programmed cell death ligand 1)是备受关注的免疫检查点分子，其功能过度增强有利于癌细胞“免疫逃逸”。肥胖状态下PD-1/PD-L1功能是否发生了有利于癌细胞“免疫逃逸”的变化，从而使癌细胞得以生存和增殖尚未可知。本研究通过建立谷氨酸钠诱导的肥胖(Monosodium glutamate-induced obesity, MSG-IO)小鼠模型，采用皮下接种小鼠肝癌细胞(H22细胞)建立移植瘤模型，观察肥胖小鼠肿瘤生长情况以及肿瘤组织PD-L1表达变化，并重点在细胞水平探讨脂肪细胞调控肿瘤细胞PD-L1表达的机制，同时也在此模型上研究多甲氧基黄酮类化合物五甲基槲皮素(Pentamethylquercetin，PMQ)对肥胖小鼠肝癌生长的抑制作用及机制。
第一部分肥胖促进肝癌生长的机制
目的：在整体和细胞水平研究肥胖促进肝癌生长的作用及可能机制。
方法：雄性CD1乳鼠出生后1-7天皮下注射谷氨酸钠(3 mg/g/d)制备MSG-IO小鼠模型，正常对照组乳鼠皮下注射等容量生理盐水。第15周龄时，处死部分小鼠测定肥胖相关指标并检测肝脏、脾脏、生殖周脂肪免疫检查点相关分子的表达水平。其余每只动物腋下一次性皮下接种105个H22细胞，接种后监测肿瘤生长情况，第10天开始每日测量肿瘤的长径和短径并计算肿瘤体积。第17天处死荷瘤小鼠，取出瘤块称重后部分固定用于免疫组化检测，剩余组织冻存用于提取蛋白行westernblot检测。细胞实验中，培养3T3-L1前脂肪细胞并诱导分化为成熟脂肪细胞，收集制备脂肪细胞条件培养基用于干预多种肿瘤细胞，观察脂肪细胞对肿瘤细胞PD-L1表达的影响；使用中和性抗体或信号通路抑制剂与脂肪细胞条件培养基共同孵育肿瘤细胞，观察肿瘤细胞PD-L1及相关信号通路分子表达的变化；提取脂肪细胞条件培养基中的外泌体检测PD-L1表达，并干预HepG2人肝癌细胞，检测PD-L1蛋白表达。
结果：(1)与正常小鼠相比，MSG-IO小鼠体重、腰围、Lee指数、脂肪、肝脏、胸腺重量显著增加，出现明显肥胖；(2)MSG-IO小鼠脾脏PD-L1和PD-1蛋白表达增加。肝脏半乳糖凝集素-9核酸水平增加，PD-L1核酸水平有上升趋势。生殖周脂肪组织PD-L1核酸水平增高，蛋白水平降低；(3)与对照组小鼠相比，MSG-IO小鼠瘤块体积和重量明显增大，肿瘤组织PD-L1蛋白表达增高，杀伤性T细胞浸润减少。肥胖小鼠瘤周脂肪PD-L1蛋白表达增高；(4)脂肪细胞条件培养基可上调人肝癌HepG2和SMMC-7721细胞PD-L1的表达，TNF-α和或IL-6中和性抗体以及STAT3抑制剂、NF-κB抑制剂可对抗脂肪细胞条件培养基上调PD-L1的作用，类似结果也在小鼠黑色素瘤B16F1细胞上发现。(5)成熟脂肪细胞PD-L1表达下降，分泌的外泌体中PD-L1表达升高；脂肪细胞来源的外泌体可上调HepG2细胞PD-L1表达。
结论：MSG-IO小鼠移植瘤生长加快，其机制可能与脂肪细胞分泌TNF-α和IL-6，促进肿瘤细胞PD-L1表达有关，脂肪细胞分泌的外泌体上调肿瘤细胞PD-L1表达也可能参与其中。
第二部分PMQ对肥胖小鼠肝癌生长的抑制作用及机制
目的：研究PMQ对MSG-IO小鼠肿瘤生长的抑制作用及可能机制。
方法：雄性昆明种小鼠乳鼠皮下注射谷氨酸钠制备MSG-IO小鼠模型。第5周龄时，MSG-IO模型组小鼠随机分为模型组和各剂量PMQ干预组(PMQ 5、10、20 mg/kg/d)，对照组与模型组使用溶剂灌胃，PMQ干预组使用不同剂量PMQ灌胃给药，每天一次。第22周龄时，每只小鼠腋下一次性皮下接种106个H22细胞。接种后第17天处死动物并取瘤称重，肿瘤组织或冻存或固定，检测肿瘤组织中PD-L1蛋白表达和T细胞浸润情况。细胞实验中，检测成熟脂肪细胞培养基中IFN-γ的浓度，利用外源性IFN-γ和中和性抗体确定IFN-γ在脂肪细胞条件培养基调控HepG2细胞PD-L1表达中的作用。检测不同浓度PMQ对HepG2细胞活力及PD-L1表达的影响；观察PMQ对脂肪细胞分化过程的影响，并观察PMQ对脂肪细胞分泌IFN-γ以及对条件培养基促进HepG2细胞PD-L1表达作用的影响。
结果：(1)MSG-IO小鼠肿瘤生长增快，PMQ可剂量依赖性地抑制MSG-IO小鼠肿瘤生长；(2)PMQ可下调MSG-IO小鼠肿瘤组织PD-L1表达并促进CD8+T细胞浸润；(3)PMQ在浓度不高于10μM时不影响HepG2细胞活力和PD-L1表达；(4)外源性IFN-γ可上调HepG2细胞PD-L1表达；脂肪细胞可分泌IFN-γ，且IFN-γ中和性抗体可对抗脂肪细胞条件培养基促进HepG2细胞PD-L1表达的作用；PMQ可减少脂肪细胞脂滴生成，抑制成熟脂肪细胞分泌IFN-γ，并下调脂肪细胞条件培养基对HepG2细胞PD-L1表达的调控作用。
结论：PMQ对MSG-IO小鼠移植瘤的生长具有明显抑制作用，此作用可能与PMQ干预脂肪细胞分化过程，减少脂肪细胞分泌IFN-γ，下调肿瘤细胞PD-L1表达有关。
第一部分肥胖促进肝癌生长的机制
目的：在整体和细胞水平研究肥胖促进肝癌生长的作用及可能机制。
方法：雄性CD1乳鼠出生后1-7天皮下注射谷氨酸钠(3 mg/g/d)制备MSG-IO小鼠模型，正常对照组乳鼠皮下注射等容量生理盐水。第15周龄时，处死部分小鼠测定肥胖相关指标并检测肝脏、脾脏、生殖周脂肪免疫检查点相关分子的表达水平。其余每只动物腋下一次性皮下接种105个H22细胞，接种后监测肿瘤生长情况，第10天开始每日测量肿瘤的长径和短径并计算肿瘤体积。第17天处死荷瘤小鼠，取出瘤块称重后部分固定用于免疫组化检测，剩余组织冻存用于提取蛋白行westernblot检测。细胞实验中，培养3T3-L1前脂肪细胞并诱导分化为成熟脂肪细胞，收集制备脂肪细胞条件培养基用于干预多种肿瘤细胞，观察脂肪细胞对肿瘤细胞PD-L1表达的影响；使用中和性抗体或信号通路抑制剂与脂肪细胞条件培养基共同孵育肿瘤细胞，观察肿瘤细胞PD-L1及相关信号通路分子表达的变化；提取脂肪细胞条件培养基中的外泌体检测PD-L1表达，并干预HepG2人肝癌细胞，检测PD-L1蛋白表达。
结果：(1)与正常小鼠相比，MSG-IO小鼠体重、腰围、Lee指数、脂肪、肝脏、胸腺重量显著增加，出现明显肥胖；(2)MSG-IO小鼠脾脏PD-L1和PD-1蛋白表达增加。肝脏半乳糖凝集素-9核酸水平增加，PD-L1核酸水平有上升趋势。生殖周脂肪组织PD-L1核酸水平增高，蛋白水平降低；(3)与对照组小鼠相比，MSG-IO小鼠瘤块体积和重量明显增大，肿瘤组织PD-L1蛋白表达增高，杀伤性T细胞浸润减少。肥胖小鼠瘤周脂肪PD-L1蛋白表达增高；(4)脂肪细胞条件培养基可上调人肝癌HepG2和SMMC-7721细胞PD-L1的表达，TNF-α和或IL-6中和性抗体以及STAT3抑制剂、NF-κB抑制剂可对抗脂肪细胞条件培养基上调PD-L1的作用，类似结果也在小鼠黑色素瘤B16F1细胞上发现。(5)成熟脂肪细胞PD-L1表达下降，分泌的外泌体中PD-L1表达升高；脂肪细胞来源的外泌体可上调HepG2细胞PD-L1表达。
结论：MSG-IO小鼠移植瘤生长加快，其机制可能与脂肪细胞分泌TNF-α和IL-6，促进肿瘤细胞PD-L1表达有关，脂肪细胞分泌的外泌体上调肿瘤细胞PD-L1表达也可能参与其中。
第二部分PMQ对肥胖小鼠肝癌生长的抑制作用及机制
目的：研究PMQ对MSG-IO小鼠肿瘤生长的抑制作用及可能机制。
方法：雄性昆明种小鼠乳鼠皮下注射谷氨酸钠制备MSG-IO小鼠模型。第5周龄时，MSG-IO模型组小鼠随机分为模型组和各剂量PMQ干预组(PMQ 5、10、20 mg/kg/d)，对照组与模型组使用溶剂灌胃，PMQ干预组使用不同剂量PMQ灌胃给药，每天一次。第22周龄时，每只小鼠腋下一次性皮下接种106个H22细胞。接种后第17天处死动物并取瘤称重，肿瘤组织或冻存或固定，检测肿瘤组织中PD-L1蛋白表达和T细胞浸润情况。细胞实验中，检测成熟脂肪细胞培养基中IFN-γ的浓度，利用外源性IFN-γ和中和性抗体确定IFN-γ在脂肪细胞条件培养基调控HepG2细胞PD-L1表达中的作用。检测不同浓度PMQ对HepG2细胞活力及PD-L1表达的影响；观察PMQ对脂肪细胞分化过程的影响，并观察PMQ对脂肪细胞分泌IFN-γ以及对条件培养基促进HepG2细胞PD-L1表达作用的影响。
结果：(1)MSG-IO小鼠肿瘤生长增快，PMQ可剂量依赖性地抑制MSG-IO小鼠肿瘤生长；(2)PMQ可下调MSG-IO小鼠肿瘤组织PD-L1表达并促进CD8+T细胞浸润；(3)PMQ在浓度不高于10μM时不影响HepG2细胞活力和PD-L1表达；(4)外源性IFN-γ可上调HepG2细胞PD-L1表达；脂肪细胞可分泌IFN-γ，且IFN-γ中和性抗体可对抗脂肪细胞条件培养基促进HepG2细胞PD-L1表达的作用；PMQ可减少脂肪细胞脂滴生成，抑制成熟脂肪细胞分泌IFN-γ，并下调脂肪细胞条件培养基对HepG2细胞PD-L1表达的调控作用。
结论：PMQ对MSG-IO小鼠移植瘤的生长具有明显抑制作用，此作用可能与PMQ干预脂肪细胞分化过程，减少脂肪细胞分泌IFN-γ，下调肿瘤细胞PD-L1表达有关。