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卵子的发生过程是生物体很重要的环节,在此期间所积累的物质为之后的受精及早期的胚胎发育提供了必不可少的母源分子,以保证胚胎在合子基因开始表达之前能够正常地发育。本文以银鲫为研究材料,初步研究了一个典型的母源分子Spindlin的生物学功能,同时,讨论了银鲫双重生殖方式的分子细胞学调控机制。
Spindlin(Spin)在鼠中报道是一个与减数分裂纺锤体相关的母源蛋白,推测其在卵胚转换中发挥重要作用。但是到现在为止,在其他脊椎动物中对Spindlin的功能研究还没有直接的证据报道。本研究利用CagSpin的特异性抗体对CagSpin在银鲫卵子发生、减数成熟以及早期胚胎发育中的表达模式和动态分布进行了研究。首先利用生物信息学方法和诱导表达分析,制备CagSpin的多克隆抗体,通过免疫定位揭示了CagSpin卵母细胞特异表达模式,及从初级卵母细胞到成熟卵子中在核仁、核质以及纺锤体之间的动态分布。在早期的初级卵母细胞和生长时期的卵母细胞中CagSpin集中在核仁上,在卵黄发生时期的卵母细胞中发生去组装,同时我们推测CagSpin可能是鱼类生长时期的卵母细胞核仁中的一个重要组成成分。CagSpin和β-tubulin的共定位分析,证实CagSpin作为纺锤体相关因子之一与成熟卵母细胞中减数分裂时期的纺锤体相互作用。进一步,通过显微注射CagSpin的特异抗体,表明CagSpin的消除会导致纺锤体组装的紊乱,进而导致第一次卵裂的阻断。因此,这些结果证实CagSpin是卵子发生、成熟以及卵胚转换中的一个关键母源因子,也是首次为Spin在脊椎动物卵胚转换中的重要生物学功能的研究提供了证据。
另外我们知道自1932年美国鱼类学家Hubbs发现第一种行雌核生殖的单性鱼--亚马逊莫莉(Poecilia formosa)以来,已在包括鱼类、两栖类和爬行类在内的约80个分类单元中发现单性脊椎动物。这些单性生物表现出单性生殖方式如雌核发育、杂合生殖或孤雌生殖,但是对于其如何保持其多倍体水平合遗传多样性始终是科学家争论的焦点问题。与其他单性物种相比较,多倍体银鲫(Carassius auratus gibelio)已经被证明具有高度的克隆多样性,而且同时存在雌核发育和两性生殖两种生殖方式。本研究通过免疫定位表明CagSpin在卵母细胞减数成熟过程中的动态变化以及在此期间与微管蛋白和染色体之间相互作用,对减数分裂纺锤体的形成和染色体的正确排列、分离进行调控。有趣的是,我们利用Spindlin和β-tubulin在减数分裂的纺锤体上的共定位,观察到银鲫卵母细胞完成了典型的减数分裂过程:第一次减数分裂排出第一极体以及受精后进行第二次减数分裂排出第二极体。通过对不同来源精子的受精卵进行荧光定位分析,结果表明CagSpin与β-tubulin共定位在解凝的雌性原核上,而且在不同来源精子的受精卵中CagSpin的存在状态存在明显的差异。此外,DAPI荧光染色以及BrdU复制掺入实验也显示在同源精子和异源精子受精的早期胚胎中存在显著不同的发育行为。在同源精子受精卵中进行有性生殖中典型的发育行为:第二次减数分裂的完成,雌性原核与雄性原核的形成与迁移,DNA复制以及两原核之间的融合,第一次卵裂和2-细胞胚胎的形成。而异源精子受精卵中则为雌核发育的过程:第二极体的排出,雌性原核DNA的复制,精核不发生解凝。但是很显然雌性原核体积增大,而且在受精后30-35分钟看到的第一次卵裂的延迟都表明在第一次卵裂前可能发生了一次内复制,从而保证雌核发育胚胎中基因组的正常倍性。本研究为我们认识银鲫的特殊生殖方式打开了新的思路,阐述了其两种生殖方式的调控机制。同时为银鲫多倍体水平的保持以及银鲫群体中的遗传多样性提供了很好的细胞学和发育生物学证据。