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E.coli表达系统因为其遗传背景清晰,速度快,成为重组蛋白表达的首选工具。对于膜蛋白和分泌型蛋白,采用常规表达方法往往很难得到具有活性的重组蛋白,需要对原有系统进行优化。本研究以禽流感病毒跨膜蛋白M2为例,借助LIC克隆和胶内荧光检测的方法,通过与不同标签蛋白融合,结合采用不同的启动子和诱导培养基,优化目的蛋白表达。结果表明:15℃条件下,采用自诱导培养基和冷诱导启动子cspA,可以介导N端融合标签蛋白的全长M2蛋白以可溶性形式表达。采用该表达系统还尝试表达了HBV和HCV的不同蛋白。
M2蛋白在各亚型禽流感病毒中高度保守,是理想的疫苗靶标。在E.coli中大量表达含有一个或三个sM2表位(缺失跨膜区的M2蛋白)的重组蛋白sM2、3sM2；将重组蛋白分别对BALB/c小鼠进行系统免疫和粘膜免疫结合的免疫程序；整个免疫过程中,3sM2比sM2更易激起sM2特异性IgG和粘膜IgA免疫应答；对于流感病毒侵染,用3sM2抗血清能使细胞获得更好的保护力。
本论文还分别对普洱茶抽提物和谷胱甘肽抗HBV的作用及其机理进行了研究,结果表明:
天然普洱茶抽提物(Pu-erh)可以抑制HepG22.2.15细胞中HBV抗原分泌；影响HBV基因组转录；抑制培养上清中HBVDNA,以及细胞内HBV复制型中间体DNA；清除细胞内活性氧(ROS)成分。
谷胱甘肽(GSH)能够抑制HepG22.2.15细胞HBV抗原分泌、基因组转录和胞内HBV复制型中间体DNA形成。RT-PCR和Westernblotting检测发现,HBV复制能够降低GSTM3和LANCLI表达,而添加GSH能够提高GSTM3和LANCLI的表达,说明这两个蛋白可能是GSH抑制HBV复制的靶标蛋白。
本论文提出了一条在E.coli中进行膜蛋白表达的方法,并通过跨膜区截短、表位叠加的方法,提高了重组M2蛋白表达量和免疫原性；检测发现Pu-erh和GSH能够抑制HBV在HepG22.2.15细胞的复制,进一步的分析表明GSTM3和LANCLI可能是GSH作用靶标。