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光合作用是水稻产量的基础,水稻灌浆期的光合能力非常重要。水稻的许多品种,特别是杂交水稻,在灌浆期叶片容易过早衰老,叶片的过早衰老直接缩短了叶片的功能期,导致光合产物的积累量减少,进而严重影响到水稻的产量。研究水稻早衰发生的分子生物学机理,对提高水稻产量,维护粮食安全具有重要的意义。突变体是研究水稻早衰的理想材料。本论文主要内容,是利用在前期构建水稻T-DNA插入突变体库的过程中筛选到的两个水稻早衰突变体开展研究:其中一个是高温敏感的水稻早衰突变体tss1,另一个是磷毒害造成营养代谢障碍的水稻早衰突变体psl1。
应用人工气候箱在控制条件下的温度胁迫试验表明,水稻突变体tss1的早衰症状受到高温胁迫的影响,处理温度越高,早衰症状就越严重,表现为高温诱导的叶片早衰症状。电镜切片观察结果表明,叶绿体是突变体tss1发生衰老起始的主要部位。遗传分析发现,该突变性状与T-DNA的插入没有关联。利用图位克隆法,我们将该突变相关基因定位到550 kb的范围内,但随后进一步扩大群体并不能得到更为精细的定位结果,显示存在某种抑制重组交换的染色体结构。后续研究表明,在tss1突变区域存在一个460 kb的倒位片段,断裂结合部位两端分别有9823bp和2141 bp的片段缺失。倒位和缺失导致TSS1基因失去启动子而失活,是导致高温诱导早衰突变性状的因为。TSS1基因在水稻叶片、茎和根中为组成型表达,在高温胁迫下,TSS1基因表达略为增加但不明显。将TSS1基因在突变体tss1中过表达,使tss1突变体增强了耐受高温胁迫的能力,回复为野生型表型。TSS1基因编码一个MCTPs蛋白(multiple C2 domain protein with two trans-membraneregions),该类蛋白的功能在植物中还鲜有报道,我们的研究说明了植物MCTPs蛋白与植物耐受环境胁迫的关联性,MCTPs蛋白可能与热激引发的Ca2+信号的传递有关。
突变体psl1是一个苗期就发生早衰的水稻突变体,该突变体从三叶期开始出现铁锈斑点,随着新叶片的生长,老叶片斑点逐步扩大直至叶尖部分黄化枯死,表现为明显的过早衰老症状。遗传学分析表明该突变性状由一对单隐性核基因控制,但同样与T-DNA的插入没有关联。利用图位法对突变基因进行遗传定位,将突变相关基因定位于第5号染色体大约67.5 kb的范围内。对该67.5 kb区间内的候选基因进行预测分析,共找到8个ORFs,其中有2个ORF编码泛素结合酶。进一步的研究结果显示,候选基因LOC_Os05g48390的外显子内部插入了一段来自于第7染色体Tos17(一个水稻逆转座子,常由组织培养引发转座)上约4.1kb的序列,由组织培养引起的Tos17插入是造成突变的因为。水稻LOC_Os05g48390基因编码的蛋白与拟南芥AtPHO2(AtUBC24)蛋白同源。而拟南芥pho2是一个磷高积累导致的磷中毒突变体,对水稻突变体psl1的有效磷含量检测证实了psl1也是一个水稻磷高积累突变体,psl1的早衰是由于磷的过度积累引起的。通过RNA干涉转基因植株,证实了LOC Os05g48390基因的表达缺失,能够造成转基因植株中磷的过度积累,证明LOC Os05g48390基因就是PSL1。通过OsMiR399f在日本晴中的过表达,证实MiR399f的过表达也能够使水稻失去磷营养的调控能力,造成水稻叶片中磷的过度积累,说明水稻中具有与拟南芥类似的磷营养调控途径。