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论文主要包括两个部分:第一部分是围绕抗生素的表达进行研究,包括对表达宿主菌的基因组改造以及抗生素生物合成基因簇的改造。通过对天蓝色链霉菌基因组抗生素合成基因簇和左臂非生长必需区域进行连续的缺失,获得了缺失了约1.2Mb的突变体ZM11。ZM11的生长速度没有明显改变,但是放线紫红素的产量却大幅提高了,更适合抗生素的表达。对灰色色素合成基因簇进行了重新构建以及用红霉素启动子的替换其本身的启动子后发现能在天蓝色链霉菌和其他三个内生链霉菌中高效表达。表明通过抗生素生物合成基因簇重构和改变抗生素生物合成原有的调控系统,有可能实现抗生素生物合成基因簇的异源过量表达。第二部分是对新的微生物资源的研究。从红豆杉中分离到了96株内生放线菌,抗菌和抗肿瘤实验结果表明红豆杉内生放线菌可能是寻找抗真菌、抗肿瘤化合物的非常有潜力的菌种资源。
1、链霉菌遗传学研究的模式菌株--天蓝色链霉菌存在23种次生产物生物合成基因簇。为了获得抗生素生物合成研究背景更清晰的菌株,我们利用有序排列的基因组文库,对天蓝色链霉菌基因组进行了改造,获得了一系列的衍生菌株。首先在大肠杆菌中构建目标基因簇精确缺失的载体,接合转移导入天蓝色链霉菌中,通过抗性筛选获得双交换的菌株。在此基础上,再导入一个在目标基因簇中不带抗性标记的载体,同样筛选双交换的菌株,即获得一个基因簇发生精确缺失、并且不带抗性标记的天蓝色链霉菌衍生菌株。重复该过程,最终构建成功了天蓝色链霉菌基因组中连续敲除并且删除了抗性标记的全部9个聚酮/聚肽类抗生素生物合成基因簇、线型染色体左臂924kb(包括coe]ibactin,deoxysugar和polyunsaturated fatty acid三个次级产物合成基因簇)的菌株ZM11,缺失片段的总长度为1.2Mb,占基因组的13.79％。在ZM11中重新导入放线紫红素生物合成基因簇,与野生型M145比较,放线紫红素的产量有较大幅度的提高。虽然在固体和液体培养基上生长速率没有明显的差异,但是ZM11的孢子形成异常,DAPI染色表明孢子中的染色体分配出现缺陷。同时次生代谢调控网络发生了重构。这些结果表明基因组改造后的突变体遗传信息更简单、背景更清晰,更适合抗生素的表达。
在链霉菌中进行抗生素生物合成基因簇的异源表达常常不能成功或者表达水平非常低。天蓝色链霉菌中的灰色色素生物合成基因簇(SC05314-5320)是目前鉴定的最小的、有颜色标记的抗生素生物合成基因簇。用“强启动子”ermE置换灰色色素基因簇本身的启动子或者把每个合成基因前连上ermE,都使基因簇的表达不受原有的调控因子的调控。此外,打乱灰色色素基因簇天然的排列顺序,将其合成基因重排后的基因簇导入天蓝色链霉菌和其他三个没有灰色背景的链霉菌菌株中,均可以提前、并且过量表达灰色色素。这些结果初步表明,通过重构和改变抗生素生物合成原有的调控系统,有可能实现抗生素生物合成基因簇的异源过量表达。
链霉菌中抗生素的表达调控非常复杂,鉴定未知的影响抗生素表达的基因对研究抗生素的表达调控以及工业应用都极为重要。天蓝色链霉菌的基因组中有一个碲抗性基因簇(ter,SCO2365-2370),其中terC(sco2366)基因编码膜蛋白,在不同链霉菌中高度保守。通过敲除天蓝色链霉菌的terC,与野生型M145相比,放线紫红素的产量显著提高,同时其菌丝体生长受到抑制。而天蓝色链霉菌中另外两个类似terC的基因SCO0562和SCO6313敲除后却没有明显的表型。RT-PCR的结果可能表明terC在天蓝色链霉菌中是间接抑制放线紫红素合成基因簇的转录。
2、基于新菌种产生新生物活性物质可能性大的想法,近年来人们将筛选新的生物活性物质的注意力逐渐集中于特殊生境的微生物如植物内生菌。有许多报道从红豆杉植物的内生真菌中检测到与寄主植物产生相同的抗肿瘤化合物紫杉醇,为了考察红豆杉内生放线菌中是否也可以产生紫杉醇,我们从四种不同的红豆杉植物中分离和初步鉴定了96株内生放线菌。利用HPLC检测它们的发酵产物没有发现紫杉醇,但是MTT法检测发现有52株菌的发酵产物抗卵巢癌活性与紫杉醇相当甚至更强。此外,抑菌试验显示,少数内生放线菌菌株对枯草芽孢杆菌与大肠杆菌有抑菌活性,大多数菌株对植物病原真菌有强的抑菌活性。这些初步的结果暗示红豆杉内生放线菌可能是寻找抗真菌、抗肿瘤化合物的非常有潜力的菌种资源。