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目的：
阿尔茨海默病(A1zheimer’s Disease，AD)，在近年来，呈不断增加的趋势，严重时甚至可以导致死亡。由于AD的病因及机制错综复杂，涉及到多系统，只有对其进行多方面的干预措施，才有可能提高防治水平。当归芍药散为多年来报道较多，且作为治疗AD有效的中医经典复方。为此，对其入血成分进一步研究，探讨具体哪些成分有效以及如何作用于靶点。同时，由于线粒体对AD的发病有至关重要的作用，为探讨当归芍药散及有效成分是否能稳定线粒体功能，降低A B对线粒体损伤，从这个角度进行深入研究当归芍药散入血成分治疗AD的作用机制。
方法：
8月龄雄性SPF级APP/PS1小鼠和野生型小鼠共85只，35～50g，各自分别随机分为正常组15只，溶媒对照组(0.9％NaCl)10只、各用药组(藁本内酯组、阿魏酸组、芍药内酯苷、川芎嗪、芍药苷)各10只，其中藁本内酯有两个剂量组，灌胃给药，一天一次，共12周。
1.当归芍药散入血成分对APP/PS1小鼠行为学的影响
(1)行为学实验预筛选
在小鼠灌胃前一周，水迷宫不设置任何站台，将小鼠放入其中，水迷宫的背景与小鼠的颜色一样，主要是为了避免干扰，小鼠游泳1min后，观察其游泳姿态，记录每只小鼠的平均游泳速度，经过对结果的分析，将游泳姿态正常和平均游泳速度类似的小鼠分为一组，然后进行后面的行为学测试，在实验过程中如若发现小鼠异常，如抽搐等情况，及时停止测试。
(2)Morris水迷宫测试
①迷宫适应训练：小鼠灌胃12周后开始进行适应训练，第1天，各小鼠训练2次，由相对应的入水点面向池壁放入水中，编为1、2、3、4号入水口，记录时间为1min。若小鼠在规定的时间即1min内，顺利找到平台，记录下来，此称为逃避潜伏期，接着强迫小鼠停留20s后再放回饲养笼;若在规定时间(1min)内没有找到平台，记录小鼠的逃避潜伏期，如上所知即lmin，然后将其引至平台，强迫停留20s后放回饲养笼。
②定位航行试验：此阶段为期5天，第4象限中心一般是放置平台的位置，每只小鼠1天训练4次，每次1个象限，入水口用阿拉伯数字表示，如1、2号，平台在第四象限。若小鼠在规定的时间即1min内，顺利找到平台，记录下来，此称为逃避潜伏期，停留10s后再放回饲养笼：若在规定时间(1min)内没有找到平台，记录为lmi n，将其引至平台，强迫停留10s后放回饲养笼。各小鼠一天接受4次训练。
③空间探索试验：在第二阶段试验结束后的次日，即第七天，此时平台去除，在第四平台象限的对应侧，即第2象限放入小鼠，记录60s内的运动轨迹，计量在第四象限的停留时间、运动轨迹。同时记录穿越原平台的次数。
(3)Y迷宫
①训练阶段：将三个臂分别设置为ABC，假定A臂为起始臂，B为新异臂，将抓住小鼠尾部，面朝壁面由A臂放入，B臂被与同色挡板盖住，观察小鼠在A和C臂中活动的时间，一般持续10min，给小鼠进行一个基本的记忆。隔1h后再进行下一个检测期。
②检测阶段：把新异臂隔板去除，同样将小鼠由起始臂放入，观察其在3个臂中自由活动的情况，持续时间为min。设置秒表，采用手动记录每只小鼠在5min内穿过各个不同的臂的次数与异常，对于特殊情况的小鼠做好标记，以便后期方便分析。在Y迷宫实验中，主要统计5mn内小鼠在ABC三个臂中的穿梭次数。
(4)旷场试验
①在无干扰、无噪音的环境下进行实验。将动物面朝壁面放入底面中心，预先设置好摄像机与计时器。观察小鼠在30min内的活动情况。提前准备好酒精与抹布，用酒精清洗方箱内壁及底面.主要目的是为了避免上只动物残留的气味、大小便等，以便下次结果测试更精确，然后再用抹布擦干后进行实验。
②主要观察指标：主要观察小鼠在中心区域活动的时间，参考以25宫格为准的中心区域。
2.当归芍药散入血成分对APP/PS1小鼠线粒体功能的影响
取材，2.5％戊二醛固定后，更换PBS，4度保存，送电镜室继续后续步骤;先用PBS漂洗5×15min;再用1％锇酸进行1-2h的固定;接着PBS漂洗3次，各持续15min：脱水的步骤依次为50％、70％、90％、丙酮各一次，每次持续20min;再用100％丙酮进行3次脱水，每次20min;浸透可以选择纯丙酮+树脂(2∶1)在室温下3-4h或者纯用丙酮+树脂(1∶2)在室温下3-4h，也可采用过夜或纯树脂过夜;在60℃高温，持续24h进行切片的包埋与聚合;然后将它们切成50-70nm的薄片;之后用醋酸双氧铀一枸橼酸铅进行双染色;最后透射电镜观察。
结果：
1.当归芍药散入血成分对APP/PS1小鼠行为学的影响
本研究选择的是，APP/PS1双转基因小鼠，将其随机分组为对照组、模型组以及各给药组，每天给药1次，持续给药12周后开始进行行为学实验。本行为学实验结果显示，在Y迷宫测试中，与对照组相比，模型组自发交替实验的百分比明显较短(P＜0.001)，差异有统计学意义;与模型组相比，芍药苷组(P＜0.001)、芍药内酯苷组(P＜0.01)、阿魏酸组(P＜0.001)、川芎嗪组(P＜0.05)、藁本内酯低剂量组(P＜0.001)、藁本内酯高剂量组(P＜0.001)差异有统计学意义(表2、图1)。
在水迷宫实验中，对照组、模型组在定位航行中的登台潜伏期延长，模型组逃避潜伏期明显延长(P＜0.05)(表3、图2);在空间探索实验中，模型组60s内穿环次数明显减少(P＜0.01)(表4、图3)。
在Morris水迷宫实验中，DSS入血成分与模型组对比，芍药内酯苷组、阿魏酸组、藁本内酯高低剂量组逃避潜伏期均明显缩短(P＜0.05)，芍药苷组、川芎嗪组逃避潜伏期无明显差异;藁本内酯高低剂量探索游过原站台位置均明显增加(P＜0.05)，芍药苷组、芍药内酯苷组、阿魏酸组、川芎嗪组无明显差异。
在旷场实验中，与对照组相比，模型组差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组相比，芍药苷组、藁本内酯低剂量组(10mg/kg)进入中心区域的时间明显减少(P＜0.05)，差异有统计学意义，其余用药组无统计学意义(表5、图4)。
结果：综合表明，当归芍药散入血成分中的藁本内酯高低剂量组、芍药内酯苷组、阿魏酸组可以改善APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆功能障碍，其中藁本内酯低剂量组要强于藁本内酯高剂量组、芍药内酯苷组、阿魏酸组，从而说明藁本内酯AD模型动物的学习记忆有较明显的改善。
2.当归芍药散入血成分对APP/PS1小鼠线粒体功能的影响
根据电镜结果，当归芍药散入血成分中藁本内酯高、低剂量组，芍药内酯苷组对AD动物模型APP/PS1双转基因小鼠的左海马CA1区的线粒体损伤均有一定的改善作用，其中藁本内酯低剂量组(10mg/kg)尤为明显，藁本内酯高剂量组(40mg/kg)与芍药内酯苷组作用较弱。
结论：
1.当归芍药散入血成分藁本内酯、芍药内酯苷、阿魏酸组对AD动物模型APP/PS1小鼠在学习记忆能力上具有改善作用。
2.当归芍药散入血成分藁本内酯、芍药内酯苷对AD动物模型APP/PS1小鼠脑内海马CA1区线粒体损伤有一定的改善作用，保护A B造成的线粒体损伤，据此推断对阿尔茨海默病的神经保护作用，其机制可能是通过改善A B造成的线粒体损伤从而起到神经保护作用。
总而言之，根据本实验结果表明，当归芍药散入血成分藁本内酯、芍药内酯苷对AD动物模型的学习记忆功能障碍有较好的改善作用，它们可能对线粒体保护、稳定线粒体功能有一定的作用，为未来开发治疗AD的新药提供新的靶点。
阿尔茨海默病(A1zheimer’s Disease，AD)，在近年来，呈不断增加的趋势，严重时甚至可以导致死亡。由于AD的病因及机制错综复杂，涉及到多系统，只有对其进行多方面的干预措施，才有可能提高防治水平。当归芍药散为多年来报道较多，且作为治疗AD有效的中医经典复方。为此，对其入血成分进一步研究，探讨具体哪些成分有效以及如何作用于靶点。同时，由于线粒体对AD的发病有至关重要的作用，为探讨当归芍药散及有效成分是否能稳定线粒体功能，降低A B对线粒体损伤，从这个角度进行深入研究当归芍药散入血成分治疗AD的作用机制。
方法：
8月龄雄性SPF级APP/PS1小鼠和野生型小鼠共85只，35～50g，各自分别随机分为正常组15只，溶媒对照组(0.9％NaCl)10只、各用药组(藁本内酯组、阿魏酸组、芍药内酯苷、川芎嗪、芍药苷)各10只，其中藁本内酯有两个剂量组，灌胃给药，一天一次，共12周。
1.当归芍药散入血成分对APP/PS1小鼠行为学的影响
(1)行为学实验预筛选
在小鼠灌胃前一周，水迷宫不设置任何站台，将小鼠放入其中，水迷宫的背景与小鼠的颜色一样，主要是为了避免干扰，小鼠游泳1min后，观察其游泳姿态，记录每只小鼠的平均游泳速度，经过对结果的分析，将游泳姿态正常和平均游泳速度类似的小鼠分为一组，然后进行后面的行为学测试，在实验过程中如若发现小鼠异常，如抽搐等情况，及时停止测试。
(2)Morris水迷宫测试
①迷宫适应训练：小鼠灌胃12周后开始进行适应训练，第1天，各小鼠训练2次，由相对应的入水点面向池壁放入水中，编为1、2、3、4号入水口，记录时间为1min。若小鼠在规定的时间即1min内，顺利找到平台，记录下来，此称为逃避潜伏期，接着强迫小鼠停留20s后再放回饲养笼;若在规定时间(1min)内没有找到平台，记录小鼠的逃避潜伏期，如上所知即lmin，然后将其引至平台，强迫停留20s后放回饲养笼。
②定位航行试验：此阶段为期5天，第4象限中心一般是放置平台的位置，每只小鼠1天训练4次，每次1个象限，入水口用阿拉伯数字表示，如1、2号，平台在第四象限。若小鼠在规定的时间即1min内，顺利找到平台，记录下来，此称为逃避潜伏期，停留10s后再放回饲养笼：若在规定时间(1min)内没有找到平台，记录为lmi n，将其引至平台，强迫停留10s后放回饲养笼。各小鼠一天接受4次训练。
③空间探索试验：在第二阶段试验结束后的次日，即第七天，此时平台去除，在第四平台象限的对应侧，即第2象限放入小鼠，记录60s内的运动轨迹，计量在第四象限的停留时间、运动轨迹。同时记录穿越原平台的次数。
(3)Y迷宫
①训练阶段：将三个臂分别设置为ABC，假定A臂为起始臂，B为新异臂，将抓住小鼠尾部，面朝壁面由A臂放入，B臂被与同色挡板盖住，观察小鼠在A和C臂中活动的时间，一般持续10min，给小鼠进行一个基本的记忆。隔1h后再进行下一个检测期。
②检测阶段：把新异臂隔板去除，同样将小鼠由起始臂放入，观察其在3个臂中自由活动的情况，持续时间为min。设置秒表，采用手动记录每只小鼠在5min内穿过各个不同的臂的次数与异常，对于特殊情况的小鼠做好标记，以便后期方便分析。在Y迷宫实验中，主要统计5mn内小鼠在ABC三个臂中的穿梭次数。
(4)旷场试验
①在无干扰、无噪音的环境下进行实验。将动物面朝壁面放入底面中心，预先设置好摄像机与计时器。观察小鼠在30min内的活动情况。提前准备好酒精与抹布，用酒精清洗方箱内壁及底面.主要目的是为了避免上只动物残留的气味、大小便等，以便下次结果测试更精确，然后再用抹布擦干后进行实验。
②主要观察指标：主要观察小鼠在中心区域活动的时间，参考以25宫格为准的中心区域。
2.当归芍药散入血成分对APP/PS1小鼠线粒体功能的影响
取材，2.5％戊二醛固定后，更换PBS，4度保存，送电镜室继续后续步骤;先用PBS漂洗5×15min;再用1％锇酸进行1-2h的固定;接着PBS漂洗3次，各持续15min：脱水的步骤依次为50％、70％、90％、丙酮各一次，每次持续20min;再用100％丙酮进行3次脱水，每次20min;浸透可以选择纯丙酮+树脂(2∶1)在室温下3-4h或者纯用丙酮+树脂(1∶2)在室温下3-4h，也可采用过夜或纯树脂过夜;在60℃高温，持续24h进行切片的包埋与聚合;然后将它们切成50-70nm的薄片;之后用醋酸双氧铀一枸橼酸铅进行双染色;最后透射电镜观察。
结果：
1.当归芍药散入血成分对APP/PS1小鼠行为学的影响
本研究选择的是，APP/PS1双转基因小鼠，将其随机分组为对照组、模型组以及各给药组，每天给药1次，持续给药12周后开始进行行为学实验。本行为学实验结果显示，在Y迷宫测试中，与对照组相比，模型组自发交替实验的百分比明显较短(P＜0.001)，差异有统计学意义;与模型组相比，芍药苷组(P＜0.001)、芍药内酯苷组(P＜0.01)、阿魏酸组(P＜0.001)、川芎嗪组(P＜0.05)、藁本内酯低剂量组(P＜0.001)、藁本内酯高剂量组(P＜0.001)差异有统计学意义(表2、图1)。
在水迷宫实验中，对照组、模型组在定位航行中的登台潜伏期延长，模型组逃避潜伏期明显延长(P＜0.05)(表3、图2);在空间探索实验中，模型组60s内穿环次数明显减少(P＜0.01)(表4、图3)。
在Morris水迷宫实验中，DSS入血成分与模型组对比，芍药内酯苷组、阿魏酸组、藁本内酯高低剂量组逃避潜伏期均明显缩短(P＜0.05)，芍药苷组、川芎嗪组逃避潜伏期无明显差异;藁本内酯高低剂量探索游过原站台位置均明显增加(P＜0.05)，芍药苷组、芍药内酯苷组、阿魏酸组、川芎嗪组无明显差异。
在旷场实验中，与对照组相比，模型组差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组相比，芍药苷组、藁本内酯低剂量组(10mg/kg)进入中心区域的时间明显减少(P＜0.05)，差异有统计学意义，其余用药组无统计学意义(表5、图4)。
结果：综合表明，当归芍药散入血成分中的藁本内酯高低剂量组、芍药内酯苷组、阿魏酸组可以改善APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆功能障碍，其中藁本内酯低剂量组要强于藁本内酯高剂量组、芍药内酯苷组、阿魏酸组，从而说明藁本内酯AD模型动物的学习记忆有较明显的改善。
2.当归芍药散入血成分对APP/PS1小鼠线粒体功能的影响
根据电镜结果，当归芍药散入血成分中藁本内酯高、低剂量组，芍药内酯苷组对AD动物模型APP/PS1双转基因小鼠的左海马CA1区的线粒体损伤均有一定的改善作用，其中藁本内酯低剂量组(10mg/kg)尤为明显，藁本内酯高剂量组(40mg/kg)与芍药内酯苷组作用较弱。
结论：
1.当归芍药散入血成分藁本内酯、芍药内酯苷、阿魏酸组对AD动物模型APP/PS1小鼠在学习记忆能力上具有改善作用。
2.当归芍药散入血成分藁本内酯、芍药内酯苷对AD动物模型APP/PS1小鼠脑内海马CA1区线粒体损伤有一定的改善作用，保护A B造成的线粒体损伤，据此推断对阿尔茨海默病的神经保护作用，其机制可能是通过改善A B造成的线粒体损伤从而起到神经保护作用。
总而言之，根据本实验结果表明，当归芍药散入血成分藁本内酯、芍药内酯苷对AD动物模型的学习记忆功能障碍有较好的改善作用，它们可能对线粒体保护、稳定线粒体功能有一定的作用，为未来开发治疗AD的新药提供新的靶点。