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目的：
前期研究表明，五生饮在细胞实验和动物实验中均存在显著的抗痫药效。本研究目的如下：
拟通过3种不同设计的细胞实验，初步探讨五生饮抗痫药效的作用途径。3种实验设计分别为：五生饮水煎剂上清液直接作用于正常的PC12细胞和谷氨酸损伤PC12细胞(实验一)；正常大鼠的五生饮含药血清作用于谷氨酸损伤PC12细胞(实验二)；致痫大鼠的五生饮含药血清作用于正常PC12细胞(实验三)。
拟使用五生饮治疗阴痫大鼠，主要通过症状学、行为学、中医证候学、病理学等指标进行药效观察(实验四)。
方法：
在实验一中，生半夏、生南星和生川乌粉碎包煎先煎，再与制白附子和黑豆共煎，得到五生饮水煎液，水煎液再经过6号筛粗过滤、离心取上清液、0.22μm滤膜过滤除菌，制备无菌五生饮上清液，最后用高糖DMEM培养液配制浓度为1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400mg/ml的五生饮上清液。空白对照组加入高糖DMEM培养液，模型对照组经谷氨酸损伤后加入高糖DMEM培养液，实验组依次加入不同浓度的五生饮上清液，分别处理正常PC12细胞和谷氨酸损伤的PC12细胞。作用24h，相差倒置显微镜观察细胞形态并拍照，MTT法检测细胞活力。
在实验二中，高脂饲料和寒性中药煎液饲养，赋予大鼠寒痰体质，不同剂量五生饮灌胃，早晚各一次，连续3天，末次灌胃1h后腹主动脉采血制备五生饮含药血清。将PC12细胞分为正常对照组、谷氨酸损伤模型组、空白血清组(正常大鼠、寒痰体质大鼠)和含药血清组(低中高剂量五生饮正常大鼠、低中高剂量五生饮寒痰体质大鼠)，正常对照组全程使用正常细胞培养液，模型组经谷氨酸损伤后换成不含血清的高糖DMEM培养液，血清组经谷氨酸损伤后换成对应的完全培养液培养。观察方法同“实验一”。
在实验三中，前述方法赋予大鼠寒痰体质，氯化锂-匹罗卡品注射法制成阴痫大鼠模型。致痫前予以各剂量五生饮灌胃，腹主动脉采血制备五生饮含药血清，将正常的PC12细胞分为空白血清组(正常大鼠、癫痫大鼠、阴痫大鼠)和含药血清组(低中高剂量五生饮癫痫大鼠、低中高剂量五生饮阴痫大鼠)，加入对应的完全培养液培养。观察方法同“实验一”。
在实验四中，前述方法制成阴痫大鼠模型，将阴痫大鼠分为对照组和治疗组，对照组给以0.9%氯化钠注射液灌胃，治疗组给予五生饮灌胃，灌胃给药持续7天，每天1次，观察大鼠的癫痫发作级别、次数、死亡情况、体重、中医证候，共28天，结束后行心脏灌注，采集脑组织，行病理切片HE染色和Nissl染色，观察海马神经元形态并进行神经元计数。
结果：
实验一：正常PC12细胞经五生饮上清液作用后，与空白对照组相比，五生饮上清液不同浓度组的OD值均下降，各组均有统计学意义，随着五生饮上清液浓度的升高，表现出细胞活力逐渐下降的趋势；谷氨酸损伤的PC12细胞经五生饮上清液作用后，与模型对照组相比，五生饮上清液各浓度组中1.5625mg/ml组、3.125mg/ml组、6.25mg/ml组、12.5mg/ml组、25mg/ml组、50mg/ml组、100mg/ml组的OD值表现出随浓度增高而逐渐上升的趋势，但均没有统计学意义；200mg/ml组和400mg/ml的OD值均下降，两组均有统计学意义。
实验二：与谷氨酸损伤模型组比较，正常对照组、空白血清组及含药血清组的OD值均升高，差异均有统计学意义。与正常大鼠空白血清组比较，正常大鼠五生饮低、中、高剂量含药血清组的OD值均升高，差异均有统计学意义，中剂量组OD值最高。与寒痰大鼠空白血清组比较，寒痰大鼠五生饮低、中、高剂量含药血清组的OD值均升高，差异均有统计学意义，中剂量组OD值最高。
实验三：与癫痫对照组比较，癫痫五生饮低、中、高剂量组的OD值均升高，差异均有统计学意义，其中以低剂量组最高。与阴痫对照组比较，阴痫五生饮低、中、高剂量组的OD值均升高，低、高剂量组差异有统计学意义，中剂量组差异无统计学意义。
实验四：在28天的观察期内，对照组与治疗组各死亡大鼠1只，死亡率无统计学差异。致痫前与观察结束时两组体重无统计学差异。两组自发癫痫大鼠数目无统计学差异，但治疗组无重度发作和极重度发作的大鼠，而对照组存在重度发作和极重度发作大鼠各1只。两组在HE染色病理切片上均可见海马神经元出现不同程度的核固缩、嗜酸性变。Nissl染色神经元计数，治疗组的神经元数量在CA1、CA3区少于对照组，差异无统计学意义，在DG区多于对照组，差异有统计学意义。
结论：
五生饮上清液可能会导致正常PC12细胞活力轻微下降；在1.5625～200mg/ml浓度范围内，可能会促进谷氨酸损伤PC12细胞的活力轻微升高，但均缺乏统计学意义。浓度过高的五生饮上清液对PC12细胞具有毒性作用。
正常大鼠和寒痰大鼠的不同剂量五生饮含药血清，均对经谷氨酸损伤造模后的PC12细胞具有显著保护作用，其中以中剂量组疗效最佳。
低、中、高剂量五生饮治疗的癫痫大鼠血清均对正常PC12细胞具有显著保护作用，减轻癫痫大鼠血清所致的细胞损害；低、高剂量五生饮治疗的阴痫大鼠血清均对正常PC12细胞具有显著保护作用，减轻阴痫大鼠血清所致的细胞损害。
本实验条件下，五生饮未能在阴痫大鼠的死亡率和发作情况方面显示出有统计学意义的疗效，但对于减少严重痫性发作可能具有一定作用，对海马DG区神经元具有保护作用。
综上所述，五生饮的抗痫作用可能主要是通过动物血清而发生全身性、复杂性、间接性的药理作用，而非药物或其中某些单体成分的直接作用。五生饮对于阴痫大鼠的作用机制，可能不仅局限于抗痫作用本身，还具有其它复杂的作用机制，最终产生神经保护和改善预后的作用。
前期研究表明，五生饮在细胞实验和动物实验中均存在显著的抗痫药效。本研究目的如下：
拟通过3种不同设计的细胞实验，初步探讨五生饮抗痫药效的作用途径。3种实验设计分别为：五生饮水煎剂上清液直接作用于正常的PC12细胞和谷氨酸损伤PC12细胞(实验一)；正常大鼠的五生饮含药血清作用于谷氨酸损伤PC12细胞(实验二)；致痫大鼠的五生饮含药血清作用于正常PC12细胞(实验三)。
拟使用五生饮治疗阴痫大鼠，主要通过症状学、行为学、中医证候学、病理学等指标进行药效观察(实验四)。
方法：
在实验一中，生半夏、生南星和生川乌粉碎包煎先煎，再与制白附子和黑豆共煎，得到五生饮水煎液，水煎液再经过6号筛粗过滤、离心取上清液、0.22μm滤膜过滤除菌，制备无菌五生饮上清液，最后用高糖DMEM培养液配制浓度为1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400mg/ml的五生饮上清液。空白对照组加入高糖DMEM培养液，模型对照组经谷氨酸损伤后加入高糖DMEM培养液，实验组依次加入不同浓度的五生饮上清液，分别处理正常PC12细胞和谷氨酸损伤的PC12细胞。作用24h，相差倒置显微镜观察细胞形态并拍照，MTT法检测细胞活力。
在实验二中，高脂饲料和寒性中药煎液饲养，赋予大鼠寒痰体质，不同剂量五生饮灌胃，早晚各一次，连续3天，末次灌胃1h后腹主动脉采血制备五生饮含药血清。将PC12细胞分为正常对照组、谷氨酸损伤模型组、空白血清组(正常大鼠、寒痰体质大鼠)和含药血清组(低中高剂量五生饮正常大鼠、低中高剂量五生饮寒痰体质大鼠)，正常对照组全程使用正常细胞培养液，模型组经谷氨酸损伤后换成不含血清的高糖DMEM培养液，血清组经谷氨酸损伤后换成对应的完全培养液培养。观察方法同“实验一”。
在实验三中，前述方法赋予大鼠寒痰体质，氯化锂-匹罗卡品注射法制成阴痫大鼠模型。致痫前予以各剂量五生饮灌胃，腹主动脉采血制备五生饮含药血清，将正常的PC12细胞分为空白血清组(正常大鼠、癫痫大鼠、阴痫大鼠)和含药血清组(低中高剂量五生饮癫痫大鼠、低中高剂量五生饮阴痫大鼠)，加入对应的完全培养液培养。观察方法同“实验一”。
在实验四中，前述方法制成阴痫大鼠模型，将阴痫大鼠分为对照组和治疗组，对照组给以0.9%氯化钠注射液灌胃，治疗组给予五生饮灌胃，灌胃给药持续7天，每天1次，观察大鼠的癫痫发作级别、次数、死亡情况、体重、中医证候，共28天，结束后行心脏灌注，采集脑组织，行病理切片HE染色和Nissl染色，观察海马神经元形态并进行神经元计数。
结果：
实验一：正常PC12细胞经五生饮上清液作用后，与空白对照组相比，五生饮上清液不同浓度组的OD值均下降，各组均有统计学意义，随着五生饮上清液浓度的升高，表现出细胞活力逐渐下降的趋势；谷氨酸损伤的PC12细胞经五生饮上清液作用后，与模型对照组相比，五生饮上清液各浓度组中1.5625mg/ml组、3.125mg/ml组、6.25mg/ml组、12.5mg/ml组、25mg/ml组、50mg/ml组、100mg/ml组的OD值表现出随浓度增高而逐渐上升的趋势，但均没有统计学意义；200mg/ml组和400mg/ml的OD值均下降，两组均有统计学意义。
实验二：与谷氨酸损伤模型组比较，正常对照组、空白血清组及含药血清组的OD值均升高，差异均有统计学意义。与正常大鼠空白血清组比较，正常大鼠五生饮低、中、高剂量含药血清组的OD值均升高，差异均有统计学意义，中剂量组OD值最高。与寒痰大鼠空白血清组比较，寒痰大鼠五生饮低、中、高剂量含药血清组的OD值均升高，差异均有统计学意义，中剂量组OD值最高。
实验三：与癫痫对照组比较，癫痫五生饮低、中、高剂量组的OD值均升高，差异均有统计学意义，其中以低剂量组最高。与阴痫对照组比较，阴痫五生饮低、中、高剂量组的OD值均升高，低、高剂量组差异有统计学意义，中剂量组差异无统计学意义。
实验四：在28天的观察期内，对照组与治疗组各死亡大鼠1只，死亡率无统计学差异。致痫前与观察结束时两组体重无统计学差异。两组自发癫痫大鼠数目无统计学差异，但治疗组无重度发作和极重度发作的大鼠，而对照组存在重度发作和极重度发作大鼠各1只。两组在HE染色病理切片上均可见海马神经元出现不同程度的核固缩、嗜酸性变。Nissl染色神经元计数，治疗组的神经元数量在CA1、CA3区少于对照组，差异无统计学意义，在DG区多于对照组，差异有统计学意义。
结论：
五生饮上清液可能会导致正常PC12细胞活力轻微下降；在1.5625～200mg/ml浓度范围内，可能会促进谷氨酸损伤PC12细胞的活力轻微升高，但均缺乏统计学意义。浓度过高的五生饮上清液对PC12细胞具有毒性作用。
正常大鼠和寒痰大鼠的不同剂量五生饮含药血清，均对经谷氨酸损伤造模后的PC12细胞具有显著保护作用，其中以中剂量组疗效最佳。
低、中、高剂量五生饮治疗的癫痫大鼠血清均对正常PC12细胞具有显著保护作用，减轻癫痫大鼠血清所致的细胞损害；低、高剂量五生饮治疗的阴痫大鼠血清均对正常PC12细胞具有显著保护作用，减轻阴痫大鼠血清所致的细胞损害。
本实验条件下，五生饮未能在阴痫大鼠的死亡率和发作情况方面显示出有统计学意义的疗效，但对于减少严重痫性发作可能具有一定作用，对海马DG区神经元具有保护作用。
综上所述，五生饮的抗痫作用可能主要是通过动物血清而发生全身性、复杂性、间接性的药理作用，而非药物或其中某些单体成分的直接作用。五生饮对于阴痫大鼠的作用机制，可能不仅局限于抗痫作用本身，还具有其它复杂的作用机制，最终产生神经保护和改善预后的作用。