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目的:从应用于临床的173味中药中,筛选出对食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞增殖均有较好抑制作用的药物,按其功效及气味归经组成方剂,观察该方对食管癌四种细胞增殖的抑制作用,研究该方对食管癌四种细胞迁移、浸润能力的影响,对食管癌细胞表皮生长因子受体(EGFR)及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)蛋白表达的影响,探讨其治疗食管癌的作用机制,为中医临床治疗食管癌提供有效方剂和实验依据。方法:将173味待选中药,经95%乙醇冷浸、过滤、干燥提取出有效成分,作用于食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞,MTT法测定对食管癌四种细胞增殖的抑制率,筛选出对四种细胞均有明显抑制作用的药物,根据药物的功效气味归经及导师临床经验组成方剂;倒置显微镜观察该方及其拆方对食管癌四种细胞形态变化的影响;流式细胞术观察该方及其拆方对食管癌四种细胞生长周期的作用;运用RTCA技术实时检测该方及其拆方对食管癌四种细胞迁移、浸润能力的影响;Wseternblot法分析该方及其拆方对食管癌四种细胞EGFR及PI3K蛋白表达的影响。
结果:1.筛选出绵萆薢、白毛藤、黑骨藤、夏天无4味均可抑制食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞生长的药物,组成清热祛湿活血方,并拆分为清热祛湿方(绵萆薢、白毛藤)及活血方(黑骨藤、夏天无)。
2.清热祛湿活血方及其拆方对食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞增殖均有明显抑制作用。
3.清热祛湿活血方及其拆方对食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞增殖抑制的量效和时效关系表明,清热祛湿活血方及其拆方对食管癌四种细胞生长的抑制作用随着药物浓度及时间的增加而增强。
4.对于细胞形态学而言,较空白组培养基中添加清热祛湿活血方及其拆方后,食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞的形态均发生明显变化。
5.流式细胞周期测试显示,用清热祛湿活血方及其拆方作用于食管癌四种细胞后,其细胞周期均发生变化。对TE-1细胞,清热祛湿活血方及其拆方将细胞周期阻滞于G1期;对EC9706细胞,清热祛湿活血方及其清热祛湿方将细胞周期阻滞于G1期,活血方阻滞于G2期;对Eca109细胞,清热祛湿活血方及其拆方将细胞周期阻滞于G2期;对EC-1细胞,清热祛湿活血方及其拆方将细胞周期阻滞于G1期。
6.RTCA实验对细胞的迁移和浸润能力进行测试发现清热祛湿活血方及其拆方均能明显抑制食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞的迁移、浸润。
7.对于信号转导通路中EGFR及PI3K蛋白的表达,与空白对照组相比,清热祛湿活血方及其拆方作用于食管癌四种细胞EGFR及PI3K蛋白的表达水平均有不同程度下调。
结论:1.绵萆薢、白毛藤、黑骨藤、夏天无四味中药对食管癌细胞增殖均有明显抑制效果;根据功效、气味归经组成清热祛湿活血方及其拆方,各方均可抑制食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞的增殖,且其抑制率随药物浓度和作用时间的增长而加强。
2.清热祛湿活血方及其拆方均能改变食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞的形态,且食管癌细胞周期均有影响,将TE-1、EC-1、EC9706细胞周期阻滞于G1期,将Eca109细胞周期阻滞于G2期。
3.清热祛湿活血方及其拆方均能抑制食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞的迁移、浸润能力。
4.清热祛湿活血方及其拆方抑制食管癌四种细胞生长作用的分子机制可能与下调其EGFR及PI3K蛋白的表达有关。
结果:1.筛选出绵萆薢、白毛藤、黑骨藤、夏天无4味均可抑制食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞生长的药物,组成清热祛湿活血方,并拆分为清热祛湿方(绵萆薢、白毛藤)及活血方(黑骨藤、夏天无)。
2.清热祛湿活血方及其拆方对食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞增殖均有明显抑制作用。
3.清热祛湿活血方及其拆方对食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞增殖抑制的量效和时效关系表明,清热祛湿活血方及其拆方对食管癌四种细胞生长的抑制作用随着药物浓度及时间的增加而增强。
4.对于细胞形态学而言,较空白组培养基中添加清热祛湿活血方及其拆方后,食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞的形态均发生明显变化。
5.流式细胞周期测试显示,用清热祛湿活血方及其拆方作用于食管癌四种细胞后,其细胞周期均发生变化。对TE-1细胞,清热祛湿活血方及其拆方将细胞周期阻滞于G1期;对EC9706细胞,清热祛湿活血方及其清热祛湿方将细胞周期阻滞于G1期,活血方阻滞于G2期;对Eca109细胞,清热祛湿活血方及其拆方将细胞周期阻滞于G2期;对EC-1细胞,清热祛湿活血方及其拆方将细胞周期阻滞于G1期。
6.RTCA实验对细胞的迁移和浸润能力进行测试发现清热祛湿活血方及其拆方均能明显抑制食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞的迁移、浸润。
7.对于信号转导通路中EGFR及PI3K蛋白的表达,与空白对照组相比,清热祛湿活血方及其拆方作用于食管癌四种细胞EGFR及PI3K蛋白的表达水平均有不同程度下调。
结论:1.绵萆薢、白毛藤、黑骨藤、夏天无四味中药对食管癌细胞增殖均有明显抑制效果;根据功效、气味归经组成清热祛湿活血方及其拆方,各方均可抑制食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞的增殖,且其抑制率随药物浓度和作用时间的增长而加强。
2.清热祛湿活血方及其拆方均能改变食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞的形态,且食管癌细胞周期均有影响,将TE-1、EC-1、EC9706细胞周期阻滞于G1期,将Eca109细胞周期阻滞于G2期。
3.清热祛湿活血方及其拆方均能抑制食管癌EC-1,Eca109,TE-1,EC9706四种细胞的迁移、浸润能力。
4.清热祛湿活血方及其拆方抑制食管癌四种细胞生长作用的分子机制可能与下调其EGFR及PI3K蛋白的表达有关。