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第一部分 成人社区获得性肺炎的临床研究研究背景 在全球范围内,社区获得性肺炎（community-acquiredpneumonia,CAP）引起的住院率及病死率比较高。目前国内外关于CAP的病原学系统性的研究多见于儿童。而关于关于成人CAP的系统性研究不多,多数研究针对不同年龄组的发病情况进行阐述。早期,我国较为大型的临床研究为刘又宁教授牵头的全国多中心成人CAP的病原学研究。近年有王辰院士、曹彬教授等牵头的全国多中心的关于成人CAP的前瞻性临床研究（本研究是其中的一个研究中心）,并以此为基础修订了2016年中国成人CAP诊断与治疗指南,指导临床医生对成人CAP进行规范诊治。目前国内外研究显示,不同地区的成人CAP的病原构成存在一定的差异。近几年随着检测技术的进步,病毒在CAP中的地位越来越受到重视。但是针对病毒性肺炎的临床特征研究的不多。此外由于各地区在用药习惯上有一定差异,不同地区对成人CAP的经验性治疗也不一样,因此不同地区的CAP对抗菌药物的耐药情况也有所不同。开展本地区成人CAP的临床研究,了解本地区成人CAP的病原学构成及耐药情况,对指导本地区CAP的经验性治疗具有一定的社会价值。据此,本研究主要了解烟台市成人CAP的病原学构成、耐药情况、各病原体肺炎的临床特点、经验性抗感染治疗的不合理用药情况、流感病毒肺炎的临床诊断与金标准病毒核酸阳性相比敏感度、特异度,评估病毒感染的临床诊断标准、30天死亡率及90天再入院率、初步探讨重症肺炎的临床特征为本市成人CAP的经验性治疗提供一定的依据,为重症肺炎的发病机制的研究提供一定的基础。目 的 1.明确烟台市成人CAP的病原构成情况。2.肺炎支原体对大环内酯类药物的耐药情况及耐药机制。3.掌握各病原体引起的CAP的临床特点。4.各病原体引起的CAP临床症状、实验室检测等方面的比较。5.临床诊断流感病毒性肺炎与金标准病毒核酸检测相比较,其灵敏度与特异度,初步建立流感病毒性肺炎的临床评估体系。6.初步分析重症肺炎的临床特征。7.初步分析烟台市成人CAP经验性治疗时抗菌药物的不适宜使用的情况。8.30天病死率及90天再入院率。方 法 本研究纳入2015.12-2017.12月入住烟台毓璜顶医院呼吸内科普通病房、符合入组条件的成人CAP患者239例。收集患者资料包括①包括患者年龄、性别、既往病史,免疫抑制剂及糖皮质激素的应用等基本信息;②流行病学信息:聚集发病情况、发病季节;③包括患者咳嗽、咳痰、头晕、恶心、腹泻等临床症状、查体阳性结果、实验室检查等资料。完善病原学检测:①病毒的检测病毒核酸PCR分子诊断;②检测肺炎军团菌及肺炎链球菌尿抗原（BINAX NOW,美国）③将鼻咽拭子、或下呼吸道标本送到中日友好医院微生物实验室用PCR技术快速检测军团菌、衣原体及肺炎支原体;④不明病原体筛查:冷链运输至中日友好医院,由国家CDC流感中心对常规检测阴性的不明原因重症肺炎病例进行宏基因筛查。计算患者的肺炎严重指数（pneumonia severity index,PSI）及CURB-65评分并进行分级。对不同病原体引起的CAP进行临床资料、实验室检查及经验性抗感染方案的分析,并进行组间比较。对耐大环内酯类药物的肺炎支原体菌株进行耐药机制的分析。结 果1.烟台市成人CAP病原分类:病毒占33.1%,肺炎支原体占21.3%,细菌占10.5%,混合感染占4.2%。2.病毒性肺炎集中在冬春季节,年龄平均:49.5±20.7岁。体温平均:37.5±1.2℃。白细胞总数平均:7.9±3.7×l09/L。热程平均:1.9±1.8天。肺部影像学表现:单肺累及的患者27例,占34.2%（27/79）;双肺累及的患者52例,占65.8%（52/79）,大部分表现为磨玻璃样渗出。病毒性肺炎中,流感病毒占53.2%（42/79）,腺病毒占17.7%（14/79）,副流感病毒占10.1%（8/79）,鼻病毒占8.8%（7/79）。病毒性肺炎中PSI分级Ⅳ级（4例）及V级（1 例）占6.3%（5/79）。1.肺炎支原体肺炎一年四季均有发病,夏季发病少,年龄平均:36.4±16.8岁;体温平均:38.5±1.3℃;白细胞总数平均:7.7±2.9×109/L,热程平均:3.3±2.1天。肺部影像学表现:7例双肺累及,占13.7%（7/51）;44例患者单肺累及,占86.3%（44/51）,多数表现为肺间质的改变。肺炎支原体肺炎患者PSI分级集中在Ⅱ级,占92.2%（47/51）。2.肺炎支原体耐药情况:体外药敏显示肺炎支原体对大环内酯类药物耐药率达100%。耐药机制为23SrRNA基因2063位点由A突变为G。3.细菌性肺炎、病毒性肺炎及支原体肺炎三者之间的比较。一般资料:三组之间在平均年龄、住院天数及平均体温方面进行比较,P＜0.05,而呼吸频率、CURB-65及PSI方面比较,P＞0.05。临床表现:咳嗽、咳痰、咳黄痰、鼻塞、畏寒、乏力及湿啰音所占比例比较,P＜0.05,而干啰音、胸痛、呼吸困难、血痰及发热患者所占比例三者之间比较,P＞0.05。实验室检查:淋巴细胞绝对计数及CRP三者比较,P＜0.05,而白细胞计数、中性粒细胞绝对计数相比较,P＞0.05。4.入院后经验性抗菌药物不适宜使用占25.2%（36/143）。5.流感病毒性肺炎的临床诊断标准与病毒核酸相比较,肺部影像联合流感季节、白细胞计数、CRP、PCT预测流感病毒肺炎的敏感度及特异度分别为8.5%,77.9%;6.1%,79.8%;4.2%,86.3%;7.0%,87.5%。而多项指标联合判定,特异度提高至98.8%。6.12 例重症社区获得性肺炎（Severe community-acquired pneumonia,SCAP）中,平均年龄:68.7±17.6岁（18,82）。8例患者（75%）合并基础疾病,中性粒细胞计数与淋巴细胞计数的比值（NLR）平均在24.2±28.8,远大于普通肺炎患者的NLR比值1.43±12.4。7..30天内病死率:2.5%;90天再入院率:9.6%。结论 1.烟台地区成人CAP病原体以病毒、肺炎支原体为主。2.细菌检出比例低,但是仍以肺炎链球菌为主。3.病毒阳性的患者中,流感病毒为主,其次是腺病毒、副流感病毒及鼻病毒。4.体外药敏实验显示:培养出的27例肺炎支原体对大环内酯类药物耐药率高达100%。但是对耐药患者应用喹诺酮类药物及大环内酯类药物治疗,发现大环内酯类药物退热时间明显长于喹诺酮类,但两组的临床治愈效果无明显统计学差异。5.细菌性肺炎、病毒性肺炎及肺炎支原体肺炎三组间进行一般资料、临床症状及实验室指标等方面进行统计学分析,发现①发病年龄:支原体组明显低于细菌组及病毒组。②住院天数:病毒性肺炎组明显长于细菌组及支原体组。③体温:细菌性肺炎的体温明显高于支原体组及病毒组。④临床症状:咳嗽在支原体肺炎组占的比例明显高于细菌及病毒组,而咳痰及咳黄痰患者的比例在细菌组明显高于病毒组及支原体组。鼻塞的症状在病毒组肺炎中更为常见。⑥实验室指标:白细胞在三组之间无明显差异,但是淋巴细胞计数、CRP在病毒组肺炎中明显低于细菌组及肺炎支原体组。6.烟台地区成人CAP患者中不合理用药（抗菌药物品种选择及用法、用量、抗感染疗程不合理）比例比较高。7.临床诊断流感病毒肺炎与金标准病毒核酸确诊病毒感染相比较,任何一种临床指标与肺部影像学结合其灵敏度,阳性预测值均比较低,但是肺部影像学与CRP、PCT、白细胞计数（＜10000）及流感季节等多项指标结合后,敏感度、特异度明显提高,可以做为流感病毒肺炎的临床诊断依据。8.重症肺炎患者平均年龄、合并基础疾病的比例及NLR 比值均明显高于普通肺炎患者。9.30天病死率及90再入院率分别为2.5%,9.6%。意 义 通过此研究了解本地成人社区获得性肺炎的病原构成、肺炎支原体对大环内酯类药物耐药的情况及评估流感病毒肺炎的临床诊断标准,为成人社区获得性肺炎的经验性治疗提供一定的参考,并为重症肺炎的发病机制的研究打下基础。第二部分 肺炎支原体感染对THP-1细胞中TLR2及细胞因子表达的影响研究背景 肺炎支原体是一种无细胞壁的最小的原核生物,不仅可以引起呼吸道感染,而且还可以累及其他脏器系统,包括肝脏、心脏、肾脏及中枢神经系统等,甚至可以引起危及生命的严重感染。关于肺炎支原体的致病机制,国内外的研究不少。既往研究发现肺炎支原体致病主要与其自身的粘附作用及分泌毒素相关。近几年随着研究的深入,发现肺炎支原体致病机制与其诱发宿主的免疫反应相关。肺炎支原体的膜脂蛋白（Lipid associated membrane proteins,LAMP-s）被认为是引发宿主免疫反应的免疫因素,可以与病原微生物表面的模式识别受体（pattern-recognition receptors,PRRs）结合,通过相应的信号通路,影响相关的细胞释放炎性因子,参与病理过程。TLR2是TOLL样受体之一,是一种跨膜蛋白,主要分布于单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞等多种免疫细胞的细胞膜上,可以与病原微生物表面上不同的病原体相关分子相结合,包括脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）,膜脂蛋白等,通过不同的信号通路影响下游各种促炎和抑炎因子的变化,参与宿主的免疫反应。研究发现TLR2、IL-10及IL-6在不同疾病中的相互作用及表达水平都不一样,有的起保护作用,有的起损害作用。目前在肺炎支原体感染患者中不同的临床研究发现,TLR2、白介素6（Lnterieukin-6,IL-6）及白介素10（Lnterleukin-10,IL-10）的相互关系及表达水平也不一样。本次研究以人单核细胞THP-1为研究对象,通过应用不同浓度的膜脂蛋白刺激THP-1,测定TLR2表达水平,研究干扰THP-1细胞中TLR2后细胞培养上清液中炎性因子IL-6、IL-10的表达水平的变化,明确膜脂蛋白的刺激是否通过TLR2调节细胞内炎性因子参与宿主免疫反应。从而从细胞水平了解肺炎支原体感染后引起宿主的免疫反应机制,为肺炎支原体的进一步研究提供一定的基础。目的 1.探究TLR2在THP-1中的表达水平与外源性膜脂蛋白刺激的关系。2.明确THP-1细胞内肺炎支原体膜脂蛋白感染是否通过TLR2介导免疫反应。3.探究细胞因子IL-6、IL-10的变化以及与TLR的关系。方法 1.应用Westemblot测定THP-1细胞中TLR2蛋白的表达水平。2.应用不同浓度的外源性膜脂蛋白刺激THP-1后,应用qPCR方法测定细胞中TLR2mRNA的表达水平。3.应用不同浓度的外源性膜脂蛋白刺激THP-1后,应用ELISA方法测定其细胞培养上清液中IL-6及IL-10的表达水平。4.干扰THP-1细胞内TLR2基因表达后,再次应用不同浓度的外源性LAMP-S刺激THP-1,应用ELISA方法测定其细胞培养上清液中IL-6及IL-10的表达水平。干扰THP-1细胞内TLR4基因表达后,并应用不同浓度的LAMP-S刺激后,测定IL-10的表达水平。结果 1.外源LAMP-S蛋白刺激能促进THP-1细胞内TLR2的表达。2.分别用2ug/ml,4ug/mlLAMP-S蛋白处理THP-1细胞时,THP-1细胞内TLR2mRNA的表达水平分别升高1.46倍和2.57倍,差异有统计学意义（P＜0.05）。3.荧光显微镜观察显示慢病毒感染THP-1细胞后,感染阳性率可达80%。分别用2ug/ml,4ug/ml LAMP-S蛋白处理干扰细胞系后,TLR2mRNA表达较KD组有所上升,但是随着LAMP-S刺激浓度的变化无明显增加。4.肺炎支原体膜脂蛋白感染后IL-6的变化当用2ug/ml,4ug/mlLAMPS蛋白处理THP-1细胞时,THP-1细胞上清中IL-6的浓度分别为1.50pg/ml和1.54pg/ml。对照组上清中IL-6的浓度为1.18pg/ml,LAMP-S刺激THP-1细胞后细胞上清内IL-6浓度有增加,差异具有统计学意义（p＜0.05）〇干扰THP-1细胞内TLR2基因表达后,THP-1细胞上清中IL-6的浓度为0.38pg/ml,较NC细胞组明显下降（p＜0.05）,再用2ug/ml,4ug/mlLAMP-S蛋白处理THP-1细胞后,细胞上清内IL-6浓度分别为0.64pg/ml和0.65pg/ml,刺激前后IL-6的表达水平的差异具有统计学意义（p＜0.05）。5.肺炎支原体膜脂蛋白感染后IL-10的变化用2ug/ml,4ug/ml LAMP-S蛋白处理THP-1细胞时,THP-1细胞上清中IL-10的浓度分别为8.01 pg/ml和8.27 pg/ml。对照组上清中IL-10的浓度为5.97pg/ml,差异具有统计学意义（p＜0.05）。干扰THP-1细胞内TLR2基因表达后,上清中IL-10的浓度为5.61pg/ml,细胞上清中IL-10含量与未干扰TLR2的对照组上清变化差异不明显。用2ug/ml,4ug/ml LAMP-S蛋白处理THP-1细胞后,细胞上清内IL-10浓度增加,分别为pg/ml和8.65pg/ml,差异具有统计学意义（p＜0.05）。千扰THP-1细胞内TLR4基因表达后,上清中IL-10的浓度为3.20pg/ml,与NC细胞相比较明显下降（p＜0.05）。用2ug/ml,4ug/mlLAMP-S蛋白处理THP-1细胞后,细胞上清内IL-10浓度增加,分别为4.94pg/ml和4.98pg/ml,与NC相比较,IL-10的表达水平具有统计学差异（p＜0.05）。结论 1.TLR2在THP-1中表达,且表达水平随着外源LAMP-S刺激浓度的增加而增加。2.干扰THP-1细胞内TLR2基因表达,应用不同浓度的外源LAMP-S刺激,干扰细胞内TLR2mRNA表达水平高于对照组,说明TLR2参与了肺炎支原体感染后引起的宿主免疫反应。3.IL-6的表达与TLR2有关,干扰THP-1细胞内TLR2表达后,IL-6的表达也随之降低。当外源LAMP-S刺激TLR2表达升高后,EL-6表达也随之上调。表明IL-6的表达有TLR2的参与。4.IL-10的表达与TLR2无关,干扰THP-1细胞内TLR2表达后,IL-10表达没有明显变化。但是外源LAMP-S刺激细胞后,细胞内IL-10表达水平有所增加,推测IL-10的表达可能不通过TLR2参与宿主免疫反应。但是干扰THP-1细胞内的TLR4表达后,IL-10的表达明显下降,推测IL-10的表达与TLR4有关。意义 初步明确肺炎支原体感染后,TLR2参与宿主的免疫反应,而且与IL-6的表达有关,IL-10的表达与TLR2无关联,而与TLR4的表达相关,为以后进一步了解其免疫机制打下了一定的研究基础。