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背景:
肿瘤因其较高的发病率和死亡率已经成为一个严重威胁人类健康的公共卫生问题。目前，化疗仍然是肿瘤治疗应用范围最广的方法之一。但是，化疗药引起的免疫抑制限制了其临床应用，而合用免疫增强剂可以有效解决这个问题。蛋氨酸脑啡肽(Methionine enkephalin, MENK)是一种含有5个氨基酸的阿片肽，在神经系统和免疫系统都有重要作用。既往关于MENK增强免疫功能的研究主要集中在MENK体外研究或单独作用，MENK对化疗宿主的免疫调节作用目前尚无报道。探究MENK对化疗宿主免疫的调节作用将为MENK今后的开发和临床应用提供实验依据。
此外，许多证据已经表明MENK通过作用阿片受体抑制胰腺癌、肝癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤发生和发展。但是，有关MENK对结肠癌的作用尚存在争议。有研究发现，肝脏过表达特异性降解MENK的酶CD10能促使结肠癌细胞转移到肝脏，这提示MENK具有潜在的抗结肠癌的作用。另有研究表明，结肠癌细胞分泌MENK抑制CD4+T和CD8+T细胞浸润肿瘤组织，增强肿瘤微环境免疫抑制状态，促进结肠癌发展。基于这一矛盾现象，MENK对结肠癌的调控作用仍有待进一步探讨。恶性肿瘤是一种全身性疾病，其发生发展伴随着代谢紊乱和免疫应答破坏。肿瘤宿主产生的炎性细胞因子驱使机体代谢改变，尤其导致肝脏糖脂代谢异常，参与肿瘤免疫抑制环境形成；同时，肿瘤宿主内髓来源抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cell, MDSC)数量增加，免疫抑制功能增强，也加重了肿瘤宿主免疫抑制状态。它们都是促进肿瘤发生发展的重要原因。既往研究表明，MENK参与调节代谢性疾病，降低血糖，减少促炎细胞因子TNF-α分泌，抑制肝脏脂质积聚。另有研究证实，MENK通过介导多种免疫细胞免疫功能，如树突状细胞、巨噬细胞等，发挥免疫增强作用。因此我们猜测，MENK通过调节炎性细胞因子改善肝脏糖脂代谢，同时也能调控MDSC数量和功能，从而介导肿瘤免疫效应，对结肠癌的发生发展产生影响。本研究通过体内体外实验研究MENK对结肠癌的抗肿瘤免疫效应，将会充实MENK在肿瘤领域的应用基础，为其辅助抗肿瘤治疗提供更多的科学依据。
目的:
本论文研究MENK对环磷酰胺(Cyclophosphamide, CTX)所致免疫低下小鼠的保护作用和免疫功能的调控作用，探讨MENK对机体免疫的影响，明确其免疫增强作用；与化疗药5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)和顺铂(Cisplatin, CDDP)分别联用于肿瘤荷瘤小鼠，探索MENK联合化疗药抑制肿瘤生长的免疫学作用；通过结肠癌荷瘤小鼠模型，从炎症、肝脏糖脂代谢及关键免疫细胞代谢和功能等角度深入探讨MENK提高抗肿瘤免疫的机制。
方法:
第一，研究MENK对CTX所致免疫低下小鼠免疫功能的影响。1)实验分组和给药处理：分为六组，正常对照组(Con)、CTX模型组、CTX+MENK高剂量组、CTX+MENK中剂量组、CTX+MENK低剂量组、CTX+TP-5阳性对照组。除正常对照组外，其他各组小鼠腹腔注射80mg/kgCTX，每天1次，连续3天，建立免疫低下动物模型。第四天开始，正常对照组和CTX模型组小鼠每天腹腔注射生理盐水，CTX+MENK高、中、低剂量组小鼠每天分别腹腔注射40、20、10mg/kgMENK，CTX+TP-5阳性对照组小鼠每天腹腔注射0.1mg/kgTP-5，每天1次，连续9天。2)检测指标：给药结束后，检测MENK对小鼠免疫器官指数和脾脏病理表现的影响；LDH法测定MENK对小鼠脾脏NK细胞数量和功能的影响；中性红法和生化法分别检测MENK对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力及释放一氧化氮(Nitric oxide, NO)的作用；流式细胞术检测小鼠脾脏Treg、骨髓、脾脏中MDSC及胸腺、淋巴结、脾脏中CD4+T和CD8+T细胞比例；MTT法检测小鼠脾脏T和B淋巴细胞增殖能力，全方位研究MENK对机体的免疫调节作用。
第二，研究MENK联合化疗对荷瘤小鼠的免疫调节作用。1)实验分组和给药处理：建立小鼠CT26结肠癌和B16黑色素瘤皮下移植瘤模型。两种荷瘤小鼠模型均分为模型组(Mod)、MENK(40)组、MENK(20)组、阳性药(TP-5)组、化疗药组(5-FU或CDDP)、化疗药(5-FU或CDDP)+MENK组、化疗药(5-FU或CDDP)+TP-5组。以对应未建立皮下移植瘤的健康小鼠为正常对照组(Con)。CT26荷瘤小鼠模型和B16荷瘤小鼠模型使用的化疗药分别是5-FU和CDDP。正常对照组和模型组每天腹注射生理盐水。MENK(40)组、MENK(20)组、阳性药(TP-5)组每天分别腹腔注射40mg/kgMENK、20mg/kgMENK和0.1mg/kgTP-5。化疗药组每两天腹腔注射一次5-FU(20 mg/kg)或CDDP(4 mg/kg)。化疗药+MENK组和化疗药+TP-5组除给予相应化疗药外，每天分别腹腔注射20mg/kgMENK和0.1mg/kgTP-5。所有组给药时间持续12天。每天测量小鼠肿瘤体积。2)检测指标：给药结束后，通过检测小鼠脾脏NK细胞比例和活性、腹腔巨噬细胞吞噬能力、脾脏Treg、骨髓和脾脏中MDSC比例、淋巴结和脾脏CD4+T和CD8+T细胞比例，研究MENK联合化疗药5-FU和CDDP对CT26荷瘤小鼠和B16荷瘤小鼠的免疫调节作用。
第三，研究MENK对结肠癌的抗肿瘤免疫调节作用及其机制。建立小鼠CT26皮下移植瘤模型，采用纳曲酮(Natrexone, NTX)阻断阿片受体信号，从炎症、肝脏糖脂代谢及关键免疫细胞代谢和功能等指标观察分析，研究MENK抗肿瘤免疫的作用机制。1)CBA法检测小鼠肿瘤组织、血清和肝脏组织细胞因子水平，确定MENK对炎性细胞因子的影响。2)qRT-PCR和Westernblot检测小鼠肝脏组织和体外培养的小鼠正常肝细胞株AML12糖脂代谢相关指标及PI3K/AKT/mTOR通路变化，明确MENK对肝脏糖脂代谢的调控作用。3)流式细胞术检测小鼠肿瘤组织和脾脏组织T细胞比例及骨髓、外周血、脾脏、肝脏、肿瘤组织MDSC比例，观察MENK对CT26荷瘤小鼠免疫状态的影响。4)检测肿瘤组织与MDSC生成和迁移相关基因表达；磁珠分选各组荷瘤小鼠脾脏MDSC，体外与T细胞共培养，同时检测免疫抑制相关基因表达，研究MENK对体内MDSC功能的影响。5)体外采用MENK处理GM-CSF和IL-6诱导骨髓细胞形成的MDSC，流式细胞术检测MDSC表型、数量、ROS生成和糖摄取，生化法检测细胞培养上清NO含量；检测MDSC功能相关和糖酵解相关基因及蛋白表达水平的变化，明确MENK体外对MDSC的作用。
结果:
第一，MENK增强CTX所致免疫低下小鼠免疫功能。1)高、中、低剂量MENK对CTX所致的小鼠体重降低均有一定的改善作用。2)高、中、低剂量MENK对CTX所致免疫低下小鼠胸腺指数和脾脏指数无显著影响，但能明显改善CTX所致小鼠脾脏损伤，增加白髓面积，其中MENK高剂量改善作用最为显著。3)与CTX模型组相比，高、中、低剂量MENK对小鼠脾脏NK细胞数目和功能的影响不具有显著差异，但能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，刺激腹腔巨噬细胞释放一氧化氮。4)高、中、低剂量MENK对CTX所致免疫低下小鼠脾脏中Treg比例无显著影响，但能明显降低小鼠骨髓和脾脏中MDSC比例。5)与CTX模型组相比，高、中、低剂量MENK对小鼠胸腺和淋巴结中CD4+T和CD8+T细胞比例均无显著影响，但高剂量和中剂量MENK能升高小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细胞比例。6)低、中、高剂量MENK能浓度依赖性地抑制CTX所致免疫低下小鼠脾脏T细胞表面免疫抑制分子PD-1表达，且高剂量和中剂量MENK作用更优。7)高、中、低剂量MENK具有促进CTX所致免疫低下小鼠脾脏T和B淋巴细胞增殖的作用。
第二，MENK联合化疗药5-FU和CDDP提高CT26荷瘤小鼠和B16荷瘤小鼠免疫功能。1)与模型组相比，MENK联合化疗药5-FU和CDDP分别抑制CT26荷瘤小鼠和B16荷瘤小鼠肿瘤体积的增长。2)与单用化疗药相比，MENK联合化疗药5-FU明显增强CT26荷瘤小鼠脾脏NK细胞活性，MENK联合CDDP显著升高B16荷瘤小鼠脾脏NK细胞数目。3)与单用化疗药相比，MENK联合化疗药5-FU能提高CT26荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力，但MENK联合CDDP对B16荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能无显著影响。4)相较于单用化疗药5-FU和CDDP，MENK联合化疗药对CT26荷瘤小鼠和B16荷瘤小鼠脾脏Treg比例均无显著影响。5)与单用化疗药相比，MENK联合化疗药能减少荷瘤小鼠骨髓和脾脏MDSC数量，其中MENK联合化疗药5-FU降低了CT26荷瘤小鼠骨髓MDSC比例，MENK联合CDDP减少了B16荷瘤小鼠脾脏MDSC比例。6)与单用化疗药相比，MENK联合化疗药5-FU和CDDP对CT26荷瘤小鼠和B16荷瘤小鼠淋巴结CD4+T和CD8+T细胞比例均无显著影响，但MENK联合CDDP能显著升高B16荷瘤小鼠脾脏CD8+T细胞比例。
第三，MENK主要通过作用阿片受体增强抗肿瘤免疫效应。1)与模型组相比，MENK组CT26荷瘤小鼠肿瘤组织、血清及肝脏中促炎细胞因子IL-6、MCP-1和TNF-α水平降低，NTX升高这些细胞因子水平。2)MENK组CT26荷瘤小鼠肝脏糖异生和脂质合成相关基因表达下降，NTX可以抑制MENK的调控作用；MENK组CT26荷瘤小鼠肝脏中乳酸、丙酮酸、HDL-C含量增加，TG、NEFA、T-CHO含量降低，NTX未见明显逆转MENK的作用。体外MENK处理的AML12细胞脂质合成减少，PI3K/AKT/mTOR通路蛋白无显著变化。3)MENK增强CT26荷瘤小鼠免疫应答，促进CD8+T细胞浸润肿瘤组织，增加脾脏CD4+T和CD8+T细胞比例，降低骨髓、外周血、脾脏、肝脏和肿瘤组织MDSC比例，NTX可以逆转MENK的作用。4)MENK能减少肿瘤组织MDSC生成和迁移相关的基因表达，这种作用可被NTX抑制；将三组CT26荷瘤小鼠脾脏分选的MDSC与T细胞共培养，MENK组MDSC对T细胞增殖抑制作用最弱，MDSC免疫抑制相关的基因表达也最低，这些作用可被NTX拮抗。5)体外实验显示，MENK抑制MDSC生成，减少NO产生，NTX有减弱MENK作用的趋势；MENK不影响MDSC的凋亡，但有促进其分化的趋势；MENK也能抑制MDSC分泌ROS，减少免疫抑制相关基因和蛋白表达，下调MDSC糖摄取能力，抑制PI3K/AKT/mTOR通路蛋白及糖酵解相关基因表达，NTX有一定逆转MENK的作用。
结论:
第一，MENK可以有效改善CTX所致的脾脏损伤，增强巨噬细胞吞噬功能，降低MDSC比例，升高CD4+T和CD8+T细胞比例，对CTX所致免疫低下小鼠具有免疫保护作用。
第二，MENK联合化疗药5-FU和CDDP抑制CT26荷瘤小鼠和B16荷瘤小鼠肿瘤体积增长，与单用化疗药相比，MENK联合化疗药通过增加NK细胞数目或功能、促进巨噬细胞吞噬能力、降低MDSC比例而增强荷瘤小鼠机体免疫功能。
第三，MENK主要通过作用阿片受体降低CT26荷瘤小鼠炎性细胞因子，抑制荷瘤鼠肝脏异常的糖异生和脂质合成，也能减少骨髓、外周血、脾脏、肝脏、肿瘤组织MDSC积聚，抑制MDSCPI3K/AKT/mTOR通路而减少其糖酵解，降低ROS产生，减弱MDSC免疫抑制功能，促进CD8+T细胞浸润肿瘤组织和免疫器官，进而增强机体抗肿瘤免疫效应。
肿瘤因其较高的发病率和死亡率已经成为一个严重威胁人类健康的公共卫生问题。目前，化疗仍然是肿瘤治疗应用范围最广的方法之一。但是，化疗药引起的免疫抑制限制了其临床应用，而合用免疫增强剂可以有效解决这个问题。蛋氨酸脑啡肽(Methionine enkephalin, MENK)是一种含有5个氨基酸的阿片肽，在神经系统和免疫系统都有重要作用。既往关于MENK增强免疫功能的研究主要集中在MENK体外研究或单独作用，MENK对化疗宿主的免疫调节作用目前尚无报道。探究MENK对化疗宿主免疫的调节作用将为MENK今后的开发和临床应用提供实验依据。
此外，许多证据已经表明MENK通过作用阿片受体抑制胰腺癌、肝癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤发生和发展。但是，有关MENK对结肠癌的作用尚存在争议。有研究发现，肝脏过表达特异性降解MENK的酶CD10能促使结肠癌细胞转移到肝脏，这提示MENK具有潜在的抗结肠癌的作用。另有研究表明，结肠癌细胞分泌MENK抑制CD4+T和CD8+T细胞浸润肿瘤组织，增强肿瘤微环境免疫抑制状态，促进结肠癌发展。基于这一矛盾现象，MENK对结肠癌的调控作用仍有待进一步探讨。恶性肿瘤是一种全身性疾病，其发生发展伴随着代谢紊乱和免疫应答破坏。肿瘤宿主产生的炎性细胞因子驱使机体代谢改变，尤其导致肝脏糖脂代谢异常，参与肿瘤免疫抑制环境形成；同时，肿瘤宿主内髓来源抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cell, MDSC)数量增加，免疫抑制功能增强，也加重了肿瘤宿主免疫抑制状态。它们都是促进肿瘤发生发展的重要原因。既往研究表明，MENK参与调节代谢性疾病，降低血糖，减少促炎细胞因子TNF-α分泌，抑制肝脏脂质积聚。另有研究证实，MENK通过介导多种免疫细胞免疫功能，如树突状细胞、巨噬细胞等，发挥免疫增强作用。因此我们猜测，MENK通过调节炎性细胞因子改善肝脏糖脂代谢，同时也能调控MDSC数量和功能，从而介导肿瘤免疫效应，对结肠癌的发生发展产生影响。本研究通过体内体外实验研究MENK对结肠癌的抗肿瘤免疫效应，将会充实MENK在肿瘤领域的应用基础，为其辅助抗肿瘤治疗提供更多的科学依据。
目的:
本论文研究MENK对环磷酰胺(Cyclophosphamide, CTX)所致免疫低下小鼠的保护作用和免疫功能的调控作用，探讨MENK对机体免疫的影响，明确其免疫增强作用；与化疗药5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)和顺铂(Cisplatin, CDDP)分别联用于肿瘤荷瘤小鼠，探索MENK联合化疗药抑制肿瘤生长的免疫学作用；通过结肠癌荷瘤小鼠模型，从炎症、肝脏糖脂代谢及关键免疫细胞代谢和功能等角度深入探讨MENK提高抗肿瘤免疫的机制。
方法:
第一，研究MENK对CTX所致免疫低下小鼠免疫功能的影响。1)实验分组和给药处理：分为六组，正常对照组(Con)、CTX模型组、CTX+MENK高剂量组、CTX+MENK中剂量组、CTX+MENK低剂量组、CTX+TP-5阳性对照组。除正常对照组外，其他各组小鼠腹腔注射80mg/kgCTX，每天1次，连续3天，建立免疫低下动物模型。第四天开始，正常对照组和CTX模型组小鼠每天腹腔注射生理盐水，CTX+MENK高、中、低剂量组小鼠每天分别腹腔注射40、20、10mg/kgMENK，CTX+TP-5阳性对照组小鼠每天腹腔注射0.1mg/kgTP-5，每天1次，连续9天。2)检测指标：给药结束后，检测MENK对小鼠免疫器官指数和脾脏病理表现的影响；LDH法测定MENK对小鼠脾脏NK细胞数量和功能的影响；中性红法和生化法分别检测MENK对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力及释放一氧化氮(Nitric oxide, NO)的作用；流式细胞术检测小鼠脾脏Treg、骨髓、脾脏中MDSC及胸腺、淋巴结、脾脏中CD4+T和CD8+T细胞比例；MTT法检测小鼠脾脏T和B淋巴细胞增殖能力，全方位研究MENK对机体的免疫调节作用。
第二，研究MENK联合化疗对荷瘤小鼠的免疫调节作用。1)实验分组和给药处理：建立小鼠CT26结肠癌和B16黑色素瘤皮下移植瘤模型。两种荷瘤小鼠模型均分为模型组(Mod)、MENK(40)组、MENK(20)组、阳性药(TP-5)组、化疗药组(5-FU或CDDP)、化疗药(5-FU或CDDP)+MENK组、化疗药(5-FU或CDDP)+TP-5组。以对应未建立皮下移植瘤的健康小鼠为正常对照组(Con)。CT26荷瘤小鼠模型和B16荷瘤小鼠模型使用的化疗药分别是5-FU和CDDP。正常对照组和模型组每天腹注射生理盐水。MENK(40)组、MENK(20)组、阳性药(TP-5)组每天分别腹腔注射40mg/kgMENK、20mg/kgMENK和0.1mg/kgTP-5。化疗药组每两天腹腔注射一次5-FU(20 mg/kg)或CDDP(4 mg/kg)。化疗药+MENK组和化疗药+TP-5组除给予相应化疗药外，每天分别腹腔注射20mg/kgMENK和0.1mg/kgTP-5。所有组给药时间持续12天。每天测量小鼠肿瘤体积。2)检测指标：给药结束后，通过检测小鼠脾脏NK细胞比例和活性、腹腔巨噬细胞吞噬能力、脾脏Treg、骨髓和脾脏中MDSC比例、淋巴结和脾脏CD4+T和CD8+T细胞比例，研究MENK联合化疗药5-FU和CDDP对CT26荷瘤小鼠和B16荷瘤小鼠的免疫调节作用。
第三，研究MENK对结肠癌的抗肿瘤免疫调节作用及其机制。建立小鼠CT26皮下移植瘤模型，采用纳曲酮(Natrexone, NTX)阻断阿片受体信号，从炎症、肝脏糖脂代谢及关键免疫细胞代谢和功能等指标观察分析，研究MENK抗肿瘤免疫的作用机制。1)CBA法检测小鼠肿瘤组织、血清和肝脏组织细胞因子水平，确定MENK对炎性细胞因子的影响。2)qRT-PCR和Westernblot检测小鼠肝脏组织和体外培养的小鼠正常肝细胞株AML12糖脂代谢相关指标及PI3K/AKT/mTOR通路变化，明确MENK对肝脏糖脂代谢的调控作用。3)流式细胞术检测小鼠肿瘤组织和脾脏组织T细胞比例及骨髓、外周血、脾脏、肝脏、肿瘤组织MDSC比例，观察MENK对CT26荷瘤小鼠免疫状态的影响。4)检测肿瘤组织与MDSC生成和迁移相关基因表达；磁珠分选各组荷瘤小鼠脾脏MDSC，体外与T细胞共培养，同时检测免疫抑制相关基因表达，研究MENK对体内MDSC功能的影响。5)体外采用MENK处理GM-CSF和IL-6诱导骨髓细胞形成的MDSC，流式细胞术检测MDSC表型、数量、ROS生成和糖摄取，生化法检测细胞培养上清NO含量；检测MDSC功能相关和糖酵解相关基因及蛋白表达水平的变化，明确MENK体外对MDSC的作用。
结果:
第一，MENK增强CTX所致免疫低下小鼠免疫功能。1)高、中、低剂量MENK对CTX所致的小鼠体重降低均有一定的改善作用。2)高、中、低剂量MENK对CTX所致免疫低下小鼠胸腺指数和脾脏指数无显著影响，但能明显改善CTX所致小鼠脾脏损伤，增加白髓面积，其中MENK高剂量改善作用最为显著。3)与CTX模型组相比，高、中、低剂量MENK对小鼠脾脏NK细胞数目和功能的影响不具有显著差异，但能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，刺激腹腔巨噬细胞释放一氧化氮。4)高、中、低剂量MENK对CTX所致免疫低下小鼠脾脏中Treg比例无显著影响，但能明显降低小鼠骨髓和脾脏中MDSC比例。5)与CTX模型组相比，高、中、低剂量MENK对小鼠胸腺和淋巴结中CD4+T和CD8+T细胞比例均无显著影响，但高剂量和中剂量MENK能升高小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细胞比例。6)低、中、高剂量MENK能浓度依赖性地抑制CTX所致免疫低下小鼠脾脏T细胞表面免疫抑制分子PD-1表达，且高剂量和中剂量MENK作用更优。7)高、中、低剂量MENK具有促进CTX所致免疫低下小鼠脾脏T和B淋巴细胞增殖的作用。
第二，MENK联合化疗药5-FU和CDDP提高CT26荷瘤小鼠和B16荷瘤小鼠免疫功能。1)与模型组相比，MENK联合化疗药5-FU和CDDP分别抑制CT26荷瘤小鼠和B16荷瘤小鼠肿瘤体积的增长。2)与单用化疗药相比，MENK联合化疗药5-FU明显增强CT26荷瘤小鼠脾脏NK细胞活性，MENK联合CDDP显著升高B16荷瘤小鼠脾脏NK细胞数目。3)与单用化疗药相比，MENK联合化疗药5-FU能提高CT26荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力，但MENK联合CDDP对B16荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能无显著影响。4)相较于单用化疗药5-FU和CDDP，MENK联合化疗药对CT26荷瘤小鼠和B16荷瘤小鼠脾脏Treg比例均无显著影响。5)与单用化疗药相比，MENK联合化疗药能减少荷瘤小鼠骨髓和脾脏MDSC数量，其中MENK联合化疗药5-FU降低了CT26荷瘤小鼠骨髓MDSC比例，MENK联合CDDP减少了B16荷瘤小鼠脾脏MDSC比例。6)与单用化疗药相比，MENK联合化疗药5-FU和CDDP对CT26荷瘤小鼠和B16荷瘤小鼠淋巴结CD4+T和CD8+T细胞比例均无显著影响，但MENK联合CDDP能显著升高B16荷瘤小鼠脾脏CD8+T细胞比例。
第三，MENK主要通过作用阿片受体增强抗肿瘤免疫效应。1)与模型组相比，MENK组CT26荷瘤小鼠肿瘤组织、血清及肝脏中促炎细胞因子IL-6、MCP-1和TNF-α水平降低，NTX升高这些细胞因子水平。2)MENK组CT26荷瘤小鼠肝脏糖异生和脂质合成相关基因表达下降，NTX可以抑制MENK的调控作用；MENK组CT26荷瘤小鼠肝脏中乳酸、丙酮酸、HDL-C含量增加，TG、NEFA、T-CHO含量降低，NTX未见明显逆转MENK的作用。体外MENK处理的AML12细胞脂质合成减少，PI3K/AKT/mTOR通路蛋白无显著变化。3)MENK增强CT26荷瘤小鼠免疫应答，促进CD8+T细胞浸润肿瘤组织，增加脾脏CD4+T和CD8+T细胞比例，降低骨髓、外周血、脾脏、肝脏和肿瘤组织MDSC比例，NTX可以逆转MENK的作用。4)MENK能减少肿瘤组织MDSC生成和迁移相关的基因表达，这种作用可被NTX抑制；将三组CT26荷瘤小鼠脾脏分选的MDSC与T细胞共培养，MENK组MDSC对T细胞增殖抑制作用最弱，MDSC免疫抑制相关的基因表达也最低，这些作用可被NTX拮抗。5)体外实验显示，MENK抑制MDSC生成，减少NO产生，NTX有减弱MENK作用的趋势；MENK不影响MDSC的凋亡，但有促进其分化的趋势；MENK也能抑制MDSC分泌ROS，减少免疫抑制相关基因和蛋白表达，下调MDSC糖摄取能力，抑制PI3K/AKT/mTOR通路蛋白及糖酵解相关基因表达，NTX有一定逆转MENK的作用。
结论:
第一，MENK可以有效改善CTX所致的脾脏损伤，增强巨噬细胞吞噬功能，降低MDSC比例，升高CD4+T和CD8+T细胞比例，对CTX所致免疫低下小鼠具有免疫保护作用。
第二，MENK联合化疗药5-FU和CDDP抑制CT26荷瘤小鼠和B16荷瘤小鼠肿瘤体积增长，与单用化疗药相比，MENK联合化疗药通过增加NK细胞数目或功能、促进巨噬细胞吞噬能力、降低MDSC比例而增强荷瘤小鼠机体免疫功能。
第三，MENK主要通过作用阿片受体降低CT26荷瘤小鼠炎性细胞因子，抑制荷瘤鼠肝脏异常的糖异生和脂质合成，也能减少骨髓、外周血、脾脏、肝脏、肿瘤组织MDSC积聚，抑制MDSCPI3K/AKT/mTOR通路而减少其糖酵解，降低ROS产生，减弱MDSC免疫抑制功能，促进CD8+T细胞浸润肿瘤组织和免疫器官，进而增强机体抗肿瘤免疫效应。