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帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是世界第二大神经退行性疾病，严重威胁老年人生命健康，给社会和家庭带来沉重的精神和经济负担。PD典型病理学特征为黑质-纹状体多巴胺能神经元进行性损伤，纹状体内多巴胺(dopamine, DA)水平显著降低。普拉克索(pramipexole, PPX)与罗匹尼罗(ropinirole, RPR)为非麦角碱类选择性多巴胺受体激动剂，能有效改善PD症状，但是长期使用时易发生耐受现象，限制了其临床应用。然而目前尚未有多巴胺受体激动剂耐受现象发生机制的研究报道，为了更好地满足其临床合理用药需求，亟需开展多巴胺受体激动剂发生耐受现象的潜在机制研究。前期研究表明，有机阳离子转运体2/3(Organic cation transporter 2/3, OCT2/3)可在PD状态下代偿损失的多巴胺转运体(dopamine tansporter，DAT)，调节脑内DA的稳态；另一方面，PPX也被证明是OCT2的底物。因此，本课题从OCT2/3角度出发，研究DA和PPX/RPR基于OCT2/3的相互作用，探究OCT2/3做为潜在靶点在PPX/RPR抗PD药理作用中的作用，同时考察PD状态下OCT2/3表达和功能的变化，以及这种变化对DA、PPX、RPR脑内处置的影响，探讨OCT2/3在PPX/RPR治疗和降效过程中的作用。
本研究首先分别建立了细胞样品及脑组织匀浆液样品中DA的两种LC-MS/MS定量分析方法，其中定量分析脑匀浆样品中DA浓度时，为规避内源性DA的影响，以d4-DA为替代分析物、以d2-DA为内标，开发了替代分析物法来进行分析。方法学验证结果表明，这两种方法灵敏度高，选择性强，有较好的准确度和精密度，基质效应与回收率变异系数均小于15%，同时具有良好的重现性和稳定性。此外，两种方法的分析时长仅为3.5min，为后续实验样品灵敏、准确、快速的定量分析奠定了基础。
为确证OCT2/3对DA、PPX和RPR的转运，考察了MDCK-OCT2、MDCK-OCT3和MDCK-mock细胞DA、PPX、RPR摄取的时间及浓度依赖性。实验结果显示除MDCK-OCT3细胞RPR摄取与mock组无显著差异外，转染细胞对三者的摄取均显著高于空载体细胞。此外，多种OCT2/3经典抑制剂对转染细胞摄取DA、PPX和RPR呈现出明显抑制作用，证明DA、PPX均为OCT2和OCT3的底物，RPR为OCT2的底物但无法被OCT3转运。随后通过转染细胞考察了DA和PPX/RPR基于OCT2/3的相互作用。结果发现PPX和RPR可抑制OCT2/3对DA的转运，其中对OCT2的抑制呈现双位点特征；反过来DA也对OCT2/3转运PPX以及OCT2转运RPR有一定的抑制作用。上述结果提示OCT2/3可能是PPX/RPR潜在作用靶点，药物可通过抑制OCT2/3介导的DA再摄取，提高突触间隙DA浓度水平从而发挥抗PD药理活性；反过来随着突触间隙DA浓度的降低，OCT2/3介导的PPX和RPR摄取失去抑制，导致二者从突触间隙转运清除加快，可能是PPX和RPR长期用药过程中发生降效现象的原因之一。
鉴于OCT2/3在PPX和RPR抗PD作用过程中可能的作用，进一步利用BV2细胞构建了PD细胞模型，并分别利用RT-qPCR和westernblot评价了模型组与对照组BV2细胞上Oct2和Oct3的基因和蛋白表达情况，同时考察了造模前后BV2细胞DA、PPX、RPR摄取变化。结果发现造模后BV2细胞中Oct2与Oct3基因和蛋白表达量均显著增加。随后的摄取及抑制实验证明了DA与PPX/RPR在BV2细胞层面上的相互作用，进一步在PD细胞模型上验证了转染细胞的实验结果。相应地，模型组BV2细胞对Oct2/3经典底物二甲双胍(metformin， MTF)以及DA、PPX、RPR的摄取显著增加，且更对抑制剂更敏感。此外，BV2细胞摄取DA、PPX及RPR的分子药动学结果表明：BV2细胞上Oct2/3除表达量增加外，功能也得到了上调。以上结果提示PD状态下OCT2/3表达及功能将会上调，使得DA、PPX和RPR的跨膜转运清除加快，导致PD状态下突触间隙DA浓度水平进一步下降，同时可能导致PPX和RPR降效现象的发生。
在细胞实验的基础上，进一步构建了小鼠PD模型，并从行为学、组织学及纹状体DA浓度三个层面进行了模型验证和评价。随后分别利用RT-qPCR和westernblot检测了模型组与对照组小鼠纹状体中Oct2/3基因及蛋白表达情况，最后从小鼠脑中提取了突触小体，考察造模前后小鼠突触小体MTF、d4-DA、PPX和RPR摄取变化。PD动物模型验证结果显示，模型组小鼠出现了PD样运动症状，同时黑质、纹状体内多巴胺能神经元显著减少，纹状体DA水平也降低至对照组的12%。RT-qPCR和westernblot的结果表明，模型组小鼠纹状体中Oct2与Oct3基因和蛋白表达量相较于对照组均显著提高。随后的摄取及抑制实验表明模型组小鼠突触小体对Oct2/3的经典底物MTF以及d4-DA、PPX、RPR的摄取明显增加，且对抑制剂更加敏感。此外，d4-DA与PPX/RPR在突触小体模型上也存在着明显的相互作用。上述研究从动物层面进一步印证了BV2细胞实验结果，为OCT2/3介导的PPX和RPR抗PD作用机制及其降效机制提供了有力证明。
为探究在PD状态下蛋白-蛋白相互作用(PPI)介导的OCT2/3功能变化机制，利用生物信息学技术构建了OCT2和OCT3蛋白质三级结构模型并进行全面优化和能量最小化处理。随后利用序列信息、结构域信息和互作网络信息对OCT2/3和与PD密切相关蛋白质的相互作用进行了预测，筛选出三个可能与OCT2发生相互作用的蛋白质DJ-1、GSTO-1、ALDH1A1以及两个可能与OCT3发生相互作用的蛋白BST1、DRP-1。然后对这些蛋白的PPI活性位点进行了预测，并根据预测位点进行分子对接生成了相应的蛋白复合物。最后通过结合能及可接触表面积筛选得到最合理的蛋白复合物构象。以上基于生物信息学的OCT2/3PPI研究为进一步利用实验方法进行OCT2/3互作蛋白的筛选和研究指明了方向，为基于PPI层面研究PD状态下OCT2/3功能发生变化的机制奠定了基础。
本研究首先分别建立了细胞样品及脑组织匀浆液样品中DA的两种LC-MS/MS定量分析方法，其中定量分析脑匀浆样品中DA浓度时，为规避内源性DA的影响，以d4-DA为替代分析物、以d2-DA为内标，开发了替代分析物法来进行分析。方法学验证结果表明，这两种方法灵敏度高，选择性强，有较好的准确度和精密度，基质效应与回收率变异系数均小于15%，同时具有良好的重现性和稳定性。此外，两种方法的分析时长仅为3.5min，为后续实验样品灵敏、准确、快速的定量分析奠定了基础。
为确证OCT2/3对DA、PPX和RPR的转运，考察了MDCK-OCT2、MDCK-OCT3和MDCK-mock细胞DA、PPX、RPR摄取的时间及浓度依赖性。实验结果显示除MDCK-OCT3细胞RPR摄取与mock组无显著差异外，转染细胞对三者的摄取均显著高于空载体细胞。此外，多种OCT2/3经典抑制剂对转染细胞摄取DA、PPX和RPR呈现出明显抑制作用，证明DA、PPX均为OCT2和OCT3的底物，RPR为OCT2的底物但无法被OCT3转运。随后通过转染细胞考察了DA和PPX/RPR基于OCT2/3的相互作用。结果发现PPX和RPR可抑制OCT2/3对DA的转运，其中对OCT2的抑制呈现双位点特征；反过来DA也对OCT2/3转运PPX以及OCT2转运RPR有一定的抑制作用。上述结果提示OCT2/3可能是PPX/RPR潜在作用靶点，药物可通过抑制OCT2/3介导的DA再摄取，提高突触间隙DA浓度水平从而发挥抗PD药理活性；反过来随着突触间隙DA浓度的降低，OCT2/3介导的PPX和RPR摄取失去抑制，导致二者从突触间隙转运清除加快，可能是PPX和RPR长期用药过程中发生降效现象的原因之一。
鉴于OCT2/3在PPX和RPR抗PD作用过程中可能的作用，进一步利用BV2细胞构建了PD细胞模型，并分别利用RT-qPCR和westernblot评价了模型组与对照组BV2细胞上Oct2和Oct3的基因和蛋白表达情况，同时考察了造模前后BV2细胞DA、PPX、RPR摄取变化。结果发现造模后BV2细胞中Oct2与Oct3基因和蛋白表达量均显著增加。随后的摄取及抑制实验证明了DA与PPX/RPR在BV2细胞层面上的相互作用，进一步在PD细胞模型上验证了转染细胞的实验结果。相应地，模型组BV2细胞对Oct2/3经典底物二甲双胍(metformin， MTF)以及DA、PPX、RPR的摄取显著增加，且更对抑制剂更敏感。此外，BV2细胞摄取DA、PPX及RPR的分子药动学结果表明：BV2细胞上Oct2/3除表达量增加外，功能也得到了上调。以上结果提示PD状态下OCT2/3表达及功能将会上调，使得DA、PPX和RPR的跨膜转运清除加快，导致PD状态下突触间隙DA浓度水平进一步下降，同时可能导致PPX和RPR降效现象的发生。
在细胞实验的基础上，进一步构建了小鼠PD模型，并从行为学、组织学及纹状体DA浓度三个层面进行了模型验证和评价。随后分别利用RT-qPCR和westernblot检测了模型组与对照组小鼠纹状体中Oct2/3基因及蛋白表达情况，最后从小鼠脑中提取了突触小体，考察造模前后小鼠突触小体MTF、d4-DA、PPX和RPR摄取变化。PD动物模型验证结果显示，模型组小鼠出现了PD样运动症状，同时黑质、纹状体内多巴胺能神经元显著减少，纹状体DA水平也降低至对照组的12%。RT-qPCR和westernblot的结果表明，模型组小鼠纹状体中Oct2与Oct3基因和蛋白表达量相较于对照组均显著提高。随后的摄取及抑制实验表明模型组小鼠突触小体对Oct2/3的经典底物MTF以及d4-DA、PPX、RPR的摄取明显增加，且对抑制剂更加敏感。此外，d4-DA与PPX/RPR在突触小体模型上也存在着明显的相互作用。上述研究从动物层面进一步印证了BV2细胞实验结果，为OCT2/3介导的PPX和RPR抗PD作用机制及其降效机制提供了有力证明。
为探究在PD状态下蛋白-蛋白相互作用(PPI)介导的OCT2/3功能变化机制，利用生物信息学技术构建了OCT2和OCT3蛋白质三级结构模型并进行全面优化和能量最小化处理。随后利用序列信息、结构域信息和互作网络信息对OCT2/3和与PD密切相关蛋白质的相互作用进行了预测，筛选出三个可能与OCT2发生相互作用的蛋白质DJ-1、GSTO-1、ALDH1A1以及两个可能与OCT3发生相互作用的蛋白BST1、DRP-1。然后对这些蛋白的PPI活性位点进行了预测，并根据预测位点进行分子对接生成了相应的蛋白复合物。最后通过结合能及可接触表面积筛选得到最合理的蛋白复合物构象。以上基于生物信息学的OCT2/3PPI研究为进一步利用实验方法进行OCT2/3互作蛋白的筛选和研究指明了方向，为基于PPI层面研究PD状态下OCT2/3功能发生变化的机制奠定了基础。