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布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是一种对人类和动物具有极大危害的人兽共患传染病。近些年，无论是人间还是畜间，我国布鲁氏菌病发病率均趋于平稳，但发病数量依旧庞大，因此，能够快速准确诊断布病具有十分重要的意义。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)被誉为可替代PCR的新兴技术，一般在20min内，37℃左右条件下便可完成反应，该技术与传统的分子生物学技术和恒温扩增技术相比，不需要复杂的仪器和设备、耗时短、操作简便、反应温度低，并且拥有多种读取结果方式。因此，本研究基于RPA技术，建立了布鲁氏菌通用型RPA-LFD快速检测方法和布鲁氏菌分型RPA检测方法。具体方法和试验结果如下：
1、根据GenBank中公布的布鲁氏菌Omp31基因，设计布鲁氏菌通用型PCR引物，根据IS711序列在布鲁氏菌种属中插入位置和拷贝数的不同，设计猪型、牛型、羊型布鲁氏菌PCR分型引物，将各目的基因分别经以上引物PCR扩增后克隆至pMD18-T载体构建重组质粒，经PCR鉴定和测序后，成功构建了通用型、猪型、牛型、羊型布鲁氏菌阳性质粒标准品，分别命名为pMD18-T-Omp31、pMD18-T-S、pMD18-T-A、pMD18-T-M，测定其浓度分别为116ng/μL、103ng/μL、95ng/μL、82ng/μL，经计算拷贝数分别为3.1×1010拷贝/μL、3.3×1010拷贝/μL、3.1×1010拷贝/μL、2.5×1010拷贝/μL。
2、基于布鲁氏菌Omp31基因保守片段设计RPA-LFD方法的引物和探针，通过对反应条件优化建立布鲁氏菌通用型重组酶聚合酶-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法，对该方法进行特异性、敏感性和重复性检测。结果显示该方法在30℃~42℃范围内，恒温反应20min以内便可肉眼观察到明显结果，特异性较好，经过三次重复，该方法均可检测出最低限为101拷贝/μL质粒标准品，比常规PCR高出100倍，敏感性高。利用该方法对虎红平板凝集试验检出的20份疑似阳性鹿血液样品提取基因组进行检测，其检测结果与常规PCR符合率为94.7%，检出阳性率优于常规PCR，同时相比常规PCR操作更简便，时间更短，本试验成功建立了一种快速检测布鲁氏菌的检测方法，该方法不需要特殊的仪器，操作简便，灵敏度高，肉眼即可观察到结果，为今后布鲁氏菌病的现场快速诊断提供了帮助。
3、根据布鲁氏菌PCR分型引物，设计猪型、牛型、羊型布鲁氏菌基础RPA引物，建立布鲁氏菌单重RPA分型检测方法，对该方法进行特异性、敏感性和重复性检测。结果显示，该方法特异性较好，经过三次重复，均可分别检出103拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL的猪型、牛型、羊型布鲁氏菌质粒标准品，敏感性较强。在此基础上，通过对反应条件的优化建立了牛型和羊型布鲁氏菌双重RPA检测方法，对该方法进行特异性、敏感性和重复性检测。特异性结果显示除A19、M5基因组呈阳性外其它病原菌均为阴性，特异性较好；敏感性和重复性试验结果显示，经过三次重复，均可检出103拷贝/μL牛型布鲁氏菌质粒标准品和102拷贝/μL羊型布鲁氏菌质粒标准品，敏感性较强。利用所建立的两种方法对之前检出的19份鹿血液阳性DNA样品分型检测，其结果相同，并与常规PCR符合率100%，本试验成功建立了布鲁氏菌分型RPA检测方法，相比于常规PCR操作简单、耗时短，为实验室分型鉴定提供了帮助。
综上所述，本研究建立了布鲁氏菌通用型RPA-LFD检测方法和布鲁氏菌分型RPA检测方法，对实现布鲁氏菌病现场快速检测和实验室简便快速分型鉴定具有重要意义，也为RPA技术在其它领域应用和实现多重化检测提供了新的途径。
1、根据GenBank中公布的布鲁氏菌Omp31基因，设计布鲁氏菌通用型PCR引物，根据IS711序列在布鲁氏菌种属中插入位置和拷贝数的不同，设计猪型、牛型、羊型布鲁氏菌PCR分型引物，将各目的基因分别经以上引物PCR扩增后克隆至pMD18-T载体构建重组质粒，经PCR鉴定和测序后，成功构建了通用型、猪型、牛型、羊型布鲁氏菌阳性质粒标准品，分别命名为pMD18-T-Omp31、pMD18-T-S、pMD18-T-A、pMD18-T-M，测定其浓度分别为116ng/μL、103ng/μL、95ng/μL、82ng/μL，经计算拷贝数分别为3.1×1010拷贝/μL、3.3×1010拷贝/μL、3.1×1010拷贝/μL、2.5×1010拷贝/μL。
2、基于布鲁氏菌Omp31基因保守片段设计RPA-LFD方法的引物和探针，通过对反应条件优化建立布鲁氏菌通用型重组酶聚合酶-侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测方法，对该方法进行特异性、敏感性和重复性检测。结果显示该方法在30℃~42℃范围内，恒温反应20min以内便可肉眼观察到明显结果，特异性较好，经过三次重复，该方法均可检测出最低限为101拷贝/μL质粒标准品，比常规PCR高出100倍，敏感性高。利用该方法对虎红平板凝集试验检出的20份疑似阳性鹿血液样品提取基因组进行检测，其检测结果与常规PCR符合率为94.7%，检出阳性率优于常规PCR，同时相比常规PCR操作更简便，时间更短，本试验成功建立了一种快速检测布鲁氏菌的检测方法，该方法不需要特殊的仪器，操作简便，灵敏度高，肉眼即可观察到结果，为今后布鲁氏菌病的现场快速诊断提供了帮助。
3、根据布鲁氏菌PCR分型引物，设计猪型、牛型、羊型布鲁氏菌基础RPA引物，建立布鲁氏菌单重RPA分型检测方法，对该方法进行特异性、敏感性和重复性检测。结果显示，该方法特异性较好，经过三次重复，均可分别检出103拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL的猪型、牛型、羊型布鲁氏菌质粒标准品，敏感性较强。在此基础上，通过对反应条件的优化建立了牛型和羊型布鲁氏菌双重RPA检测方法，对该方法进行特异性、敏感性和重复性检测。特异性结果显示除A19、M5基因组呈阳性外其它病原菌均为阴性，特异性较好；敏感性和重复性试验结果显示，经过三次重复，均可检出103拷贝/μL牛型布鲁氏菌质粒标准品和102拷贝/μL羊型布鲁氏菌质粒标准品，敏感性较强。利用所建立的两种方法对之前检出的19份鹿血液阳性DNA样品分型检测，其结果相同，并与常规PCR符合率100%，本试验成功建立了布鲁氏菌分型RPA检测方法，相比于常规PCR操作简单、耗时短，为实验室分型鉴定提供了帮助。
综上所述，本研究建立了布鲁氏菌通用型RPA-LFD检测方法和布鲁氏菌分型RPA检测方法，对实现布鲁氏菌病现场快速检测和实验室简便快速分型鉴定具有重要意义，也为RPA技术在其它领域应用和实现多重化检测提供了新的途径。