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猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是冠状病毒科属成员，可以使猪群出现腹泻、呕吐等症状，哺乳仔猪的发病率和致死率均很高，对生猪养殖业造成了巨大的损失。就目前而言，对于PEDV致病机制的研究并不全面，仍需要进一步探索。近年来人们发现一种细胞外囊泡—外泌体，可能对于病毒感染宿主十分重要。它是通过细胞内多泡体与细胞膜融合产生的纳米级细胞外囊泡，广泛分布在血清、尿液、唾液和其他生物液体中。外泌体作为细胞间通讯和遗传物质的重要转移载体，可以通过受体介导的相互作用或通过各种生物活性分子(如细胞膜受体、蛋白质、microRNA)的转移直接刺激靶细胞，从而发挥其生物学功能。microRNA是一类能够通过多种机制调节基因表达的单链非编码小RNA分子，存在于动物、植物、病毒中。目前，已有研究发现多种病毒外泌体microRNA参与了病毒感染的过程，但是有关PEDV感染的外泌体microRNA的研究却很少。因此研究PEDV外泌体microRNA在病毒感染中的作用，对进一步探索PEDV致病的分子机制具有重要意义。
本研究采用超滤法结合外泌体沉淀试剂提取PEDV感染Vero细胞外泌体，并且通过透射电镜(Transmission electron microscopy, TEM)观察外泌体形态以及Westernblot检测外泌体标志蛋白等方法，对分离到的外泌体进行鉴定。随后，通过RT-qPCR及结晶紫染色等方法探究外泌体能否促进病毒感染。同时，对PEDV感染组及对照组外泌体microRNA进行高通量测序，根据测序结果对表达差异的microRNA进行靶基因预测以及靶基因KEGGpathway注释，再对注释到pathway的靶基因进行富集因子分析及Pvalue检测，筛选出具有研究价值的KEGGpathway。最后，使用生物信息学软件预测差异表达microRNA和靶基因的结合位点，将microRNA的mimics和inhibitor转染到细胞中，并通过RT-qPCR，Westernblot和双荧光素酶报告基因等方法验证microRNA是否可以影响靶基因的表达。
我们成功提取到PEDV外泌体并发现外泌体可以促进病毒的感染；同时得到差异表达的microRNA861个，包括上调388个，下调473个；这其中差异表达显著的microRNA有43个，上调18个和下调25个。共预测到15167个靶基因，在这些靶基因中有8329个获得到注释信息，成功筛选出具有研究价值的KEGGpathway—紧密连接(Tight Junction, TJ)。从这些差异表达显著的microRNA中共筛选出8个靶向TJ的microRNA，包括上调的microRNA∶novel-miR-287及novel-miR-94；下调的microRNA∶miR-328-3p、novel-miR-239、novel-miR-295、novel-miR-345、novel-miR-411、novel-miR-476。最后我们从上述的8个microRNA中选择一个进行验证，即miR-328-3p，而验证结果也表明，miR-328-3p可以直接影响靶基因ZO-3的表达。
综上，本研究成功提取到PEDV感染后的细胞外泌体，且通过高通量测序、RT-qPCR、Westernblot和双荧光素酶等方法发现一个可以直接影响紧密连接蛋白表达的microRNA，即miR-328-3p。而这无疑是为进一步探索PEDV致病的分子机制以及治疗猪流行性腹泻新手段提供依据。
本研究采用超滤法结合外泌体沉淀试剂提取PEDV感染Vero细胞外泌体，并且通过透射电镜(Transmission electron microscopy, TEM)观察外泌体形态以及Westernblot检测外泌体标志蛋白等方法，对分离到的外泌体进行鉴定。随后，通过RT-qPCR及结晶紫染色等方法探究外泌体能否促进病毒感染。同时，对PEDV感染组及对照组外泌体microRNA进行高通量测序，根据测序结果对表达差异的microRNA进行靶基因预测以及靶基因KEGGpathway注释，再对注释到pathway的靶基因进行富集因子分析及Pvalue检测，筛选出具有研究价值的KEGGpathway。最后，使用生物信息学软件预测差异表达microRNA和靶基因的结合位点，将microRNA的mimics和inhibitor转染到细胞中，并通过RT-qPCR，Westernblot和双荧光素酶报告基因等方法验证microRNA是否可以影响靶基因的表达。
我们成功提取到PEDV外泌体并发现外泌体可以促进病毒的感染；同时得到差异表达的microRNA861个，包括上调388个，下调473个；这其中差异表达显著的microRNA有43个，上调18个和下调25个。共预测到15167个靶基因，在这些靶基因中有8329个获得到注释信息，成功筛选出具有研究价值的KEGGpathway—紧密连接(Tight Junction, TJ)。从这些差异表达显著的microRNA中共筛选出8个靶向TJ的microRNA，包括上调的microRNA∶novel-miR-287及novel-miR-94；下调的microRNA∶miR-328-3p、novel-miR-239、novel-miR-295、novel-miR-345、novel-miR-411、novel-miR-476。最后我们从上述的8个microRNA中选择一个进行验证，即miR-328-3p，而验证结果也表明，miR-328-3p可以直接影响靶基因ZO-3的表达。
综上，本研究成功提取到PEDV感染后的细胞外泌体，且通过高通量测序、RT-qPCR、Westernblot和双荧光素酶等方法发现一个可以直接影响紧密连接蛋白表达的microRNA，即miR-328-3p。而这无疑是为进一步探索PEDV致病的分子机制以及治疗猪流行性腹泻新手段提供依据。