论文部分内容阅读
禽白血病(Avian Leukosis, AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian Sarcoma Virus, ASV)引起的禽类肿瘤性传染病的统称。在禽白血病A、B、C、D、E和J等10个亚群中，J亚群对商品鸡的致病性和感染性最强，主要引起禽骨髓瘤白血病，给养禽业造成了巨大的经济损失。禽白血病至今尚无有效的预防疫苗和治疗药物，当前禽白血病防控的方法仍是种群的净化。因此，建立快速、简便、有效的检测方法对于禽白血病的净化至关重要。
禽白血病病毒由gag、pol和env三个基因组成。各亚群之间禽白血病病毒的gag和pol高度保守，同源性为96%-97%。禽白血病亚群特异性主要是由env基因编码的表面囊膜蛋白gp85所决定，而J亚群与其它亚群的gp85基因同源性仅40%左右。gp85编码ALV受体结合决定簇,通过与宿主细胞表面受体结合，使gp37构象发生改变，并通过gp37编码的穿膜蛋白定位到细胞膜上，最终使病毒与宿主的细胞膜融合。因此，J亚群的gp85基因是检测J亚群禽白血病特异性的抗原基因。本研究克隆表达了J亚群的gp85基因，制备单克隆抗体，建立了双抗夹心ELISA方法，初步应用于J亚群禽白血病的临床检测，效果显著。内容如下：
J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆、原核表达及纯化：本研究以J亚群禽白血病前病毒cDNA为模板，扩增出gp85基因，构建了克隆质粒pMD-ALV-J-gp85和表达质粒pET-ALV-J-gp85，将表达质粒转化到BL21(DE3)中进行诱导表达,筛选并纯化了ALV-J-gp85重组蛋白。结果表明，成功扩增出924bp大小的J亚群gp85基因，该基因核苷酸序列与GenBank中的J亚群(HPRS-103株)核苷酸序列同源性为100%。成功表达了ALV-J-gp85重组蛋白，该蛋白为可溶性目的蛋白，将此蛋白纯化，纯化浓度为80mg/L,效果理想。
J亚群禽白血病病毒gp85蛋白单克隆抗体的制备及纯化：取纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠3次，测定抗体效价，取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，经亚克隆筛选，获得单克隆抗体，并对其生物学特性进行了鉴定。结果表明，筛选获1A11,3C7,3C9,4G6和5F4五株阳性的杂交瘤细胞系,经亚类鉴定5F4为IgG2b亚型，其余4株为IgG1亚型。间接ELISA方法结果证明，单抗仅与ALV-J反应(OD值在1.0以上)，而与ALV-A、ALV-B、NDV、IBV、REV无交叉反应，表明所获得的单抗具有良好的特异性。通过WesternBlot鉴定，五株单抗均可识别J型禽白血病gp85蛋白，说明所获得的单抗具有良好的反应性和特异性。
双抗夹心ELISA方法的建立：将纯化后的单克隆抗体用活化辣根过氧化物酶标记试剂盒进行HRP标记，对最佳包被抗体与标记抗体进行了选择。在此基础上针对抗原最佳稀释度、最佳封闭液、最佳显色时间、阴阳性判断标准等方面进行了优化。最后通过特异性试验、重复性试验、敏感性试验、符合性试验、临床检测对建立的方法进行验证。结果显示，所建立的双抗夹心ELISA法与IDEXX试剂盒的符合率是94%，且具有良好的特异性、重复性、敏感性。
本研究通过克隆表达ALV-J-gp85基因，制备单克隆抗体，不断优化各种实验条件，制定判定标准，建立了针对J亚群禽白血病的双抗夹心ELISA方法，旨在为禽白血病检测试剂盒的研制、禽白血病的净化工作提供理论基础。
禽白血病病毒由gag、pol和env三个基因组成。各亚群之间禽白血病病毒的gag和pol高度保守，同源性为96%-97%。禽白血病亚群特异性主要是由env基因编码的表面囊膜蛋白gp85所决定，而J亚群与其它亚群的gp85基因同源性仅40%左右。gp85编码ALV受体结合决定簇,通过与宿主细胞表面受体结合，使gp37构象发生改变，并通过gp37编码的穿膜蛋白定位到细胞膜上，最终使病毒与宿主的细胞膜融合。因此，J亚群的gp85基因是检测J亚群禽白血病特异性的抗原基因。本研究克隆表达了J亚群的gp85基因，制备单克隆抗体，建立了双抗夹心ELISA方法，初步应用于J亚群禽白血病的临床检测，效果显著。内容如下：
J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆、原核表达及纯化：本研究以J亚群禽白血病前病毒cDNA为模板，扩增出gp85基因，构建了克隆质粒pMD-ALV-J-gp85和表达质粒pET-ALV-J-gp85，将表达质粒转化到BL21(DE3)中进行诱导表达,筛选并纯化了ALV-J-gp85重组蛋白。结果表明，成功扩增出924bp大小的J亚群gp85基因，该基因核苷酸序列与GenBank中的J亚群(HPRS-103株)核苷酸序列同源性为100%。成功表达了ALV-J-gp85重组蛋白，该蛋白为可溶性目的蛋白，将此蛋白纯化，纯化浓度为80mg/L,效果理想。
J亚群禽白血病病毒gp85蛋白单克隆抗体的制备及纯化：取纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠3次，测定抗体效价，取脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，经亚克隆筛选，获得单克隆抗体，并对其生物学特性进行了鉴定。结果表明，筛选获1A11,3C7,3C9,4G6和5F4五株阳性的杂交瘤细胞系,经亚类鉴定5F4为IgG2b亚型，其余4株为IgG1亚型。间接ELISA方法结果证明，单抗仅与ALV-J反应(OD值在1.0以上)，而与ALV-A、ALV-B、NDV、IBV、REV无交叉反应，表明所获得的单抗具有良好的特异性。通过WesternBlot鉴定，五株单抗均可识别J型禽白血病gp85蛋白，说明所获得的单抗具有良好的反应性和特异性。
双抗夹心ELISA方法的建立：将纯化后的单克隆抗体用活化辣根过氧化物酶标记试剂盒进行HRP标记，对最佳包被抗体与标记抗体进行了选择。在此基础上针对抗原最佳稀释度、最佳封闭液、最佳显色时间、阴阳性判断标准等方面进行了优化。最后通过特异性试验、重复性试验、敏感性试验、符合性试验、临床检测对建立的方法进行验证。结果显示，所建立的双抗夹心ELISA法与IDEXX试剂盒的符合率是94%，且具有良好的特异性、重复性、敏感性。
本研究通过克隆表达ALV-J-gp85基因，制备单克隆抗体，不断优化各种实验条件，制定判定标准，建立了针对J亚群禽白血病的双抗夹心ELISA方法，旨在为禽白血病检测试剂盒的研制、禽白血病的净化工作提供理论基础。