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犬瘟热(Canine distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)引起多种食肉动物共患高度接触性传染病。CDV感染宿主范围由最初的犬科逐渐扩展到猫科、鼬科、猴科和西貒科等，其宿主范围还有继续扩大的趋势。近年来，在我国山东和辽宁省等地毛皮动物(水貂、狐狸和貉)规模养殖区犬瘟热频繁爆发，给我国养殖业造成严重的经济损失。为了解CDV流行毒株特点，我们从基因遗传进化特点、宿主致病性、细胞和分子水平几方面进行了病毒生物学特性研究。
本研究对来源我国山东水貂CDV野毒株SDZC(17)M2和辽宁水貂野毒株LNDL(17)M4进行全基因组测序，获得2株病毒的全基因组信息。H基因序列分析表明，LNDL(17)M4株549位氨基酸发生Y549H突变，而SDZC(17)M2株542和549位氨基酸发生I542N/Y549H双突变。F基因序列分析显示SDZC(17)M2株保守的切割位点RRQRR发生了RRQKR突变。遗传进化分析显示CDVHI542N/Y549H变异株形成一个独立的分支。SDZC(17)M2和LNDL(17)M4株与其他CDVHI542N/Y549H变异株相似度分别为99.3~99.6%nt和97.7~97.9%nt。全基因组序列分析显示CDVHI542N/Y549H变异株与其他毒株在基因编码区共有16个氨基酸位点发生突变，在非编码区共有11个核苷酸位点发生突变。
为进一步研究上述CDVSDZC(17)M2和LNDL(17)M4株对水貂毒力、体内组织嗜性和诱导宿主免疫抑制水平，应用3株CDV野毒株SDZC(17)M2、LNDL(17)M4和Hebei(未变异株)，分别经鼻腔接种(104.0 TCID50)3组60日龄水貂进行人工感染试验，评价其临床特征、病毒毒力、免疫抑制、各组织病毒RNA载量及细胞因子TNF-α、IFN-α、IFN-β和IL-4应答水平。临床结果表明：3株代表毒株导致水貂出现不同程度的临床症状和多系统器官的病理学损伤；SDZC(17)M2、Hebei和LNDL(17)M4组致死率分别为80%、20%和0。病毒毒力和免疫抑制水平结果表明：SDZC(17)M2、Hebei和LNDL(17)M4组对水貂毒力和免疫抑制分数分别为2/2.67、1.1/2、0.8/1.73。病毒RNA载量检测结果表明：3株CDV毒株均能在体内靶器官内有效增殖，SDZC(17)M2感染组在肺、淋巴结和肾中的病毒RNA载量最高可达109copies/mL，显著高于Hebei和LNDL(17)M4组(P＜0.05)。SDZC(17)M2感染组水貂在第14天眼鼻和直肠拭子中病毒RNA载量均显著高于其它2组(P＜0.05)。试验还发现3株毒株感染水貂3~10天TNF-αmRNA转录水平下调，第14天mRNA转录水平恢复正常；在3~10天，而IFN-α和IFN-βmRNA转录水平没有明显变化，第14天IFN-α和IFN-βmRNA转录水平上调；在3~21天，IL-4mRNA转录水平下调。3株毒株在表达水貂SLAM的BHK细胞系(BHK-minkSLAM, BMS)上生长曲线分析表明，SDZC(17)M2变异株的合胞体数(68 )和病毒含量(105.4TCID50 )均显著高于LNDL(17)M4和Hebei毒株合胞体数(32和27)和病毒含量(104.3TCID50和104.1TCID50)((P＜0.01；P＜0.001)。
为了揭示CDV变异株H蛋白I542N和Y549H位氨基酸突变是否影响与水貂SLAM/Nectin-4受体相互作用，本研究利用定点突变技术，构建了SDZC(17)M2H蛋白N542I和H549Y位氨基酸单突变及双突变真核表达质粒。免疫共沉淀试验结果显示：Y549H突变增强了与水貂SLAM受体相互作用，而未改变与水貂Nectin-4受体相互作用，我们推测CDVHY549H突变可能增强与水貂SLAM受体的亲和力。
本研究中，我们也验证了首次报道的SDZC(17)M2变异株F蛋白保守的切割位点R223K位氨基酸突变对水貂SLAM/Nectin-4的融合效率，细胞融合及双荧光素报告基因试验结果显示，新发现的F蛋白R223K位氨基酸突变未改变与水貂SLAM/Nectin-4受体的融合效率，推测R223K位氨基酸突变不会影响病毒与受体相互作用。
综上所述，本研究分析了我国山东省CDV变异株与其他毒株在遗传进化、致病性方面的差异性及H、F基因与受体结合区关键氨基酸位点变异对受体结合特性的影响，为深入研究CDV的进化规律、分子致病机制及毛皮动物犬瘟热防控提供了依据。
本研究对来源我国山东水貂CDV野毒株SDZC(17)M2和辽宁水貂野毒株LNDL(17)M4进行全基因组测序，获得2株病毒的全基因组信息。H基因序列分析表明，LNDL(17)M4株549位氨基酸发生Y549H突变，而SDZC(17)M2株542和549位氨基酸发生I542N/Y549H双突变。F基因序列分析显示SDZC(17)M2株保守的切割位点RRQRR发生了RRQKR突变。遗传进化分析显示CDVHI542N/Y549H变异株形成一个独立的分支。SDZC(17)M2和LNDL(17)M4株与其他CDVHI542N/Y549H变异株相似度分别为99.3~99.6%nt和97.7~97.9%nt。全基因组序列分析显示CDVHI542N/Y549H变异株与其他毒株在基因编码区共有16个氨基酸位点发生突变，在非编码区共有11个核苷酸位点发生突变。
为进一步研究上述CDVSDZC(17)M2和LNDL(17)M4株对水貂毒力、体内组织嗜性和诱导宿主免疫抑制水平，应用3株CDV野毒株SDZC(17)M2、LNDL(17)M4和Hebei(未变异株)，分别经鼻腔接种(104.0 TCID50)3组60日龄水貂进行人工感染试验，评价其临床特征、病毒毒力、免疫抑制、各组织病毒RNA载量及细胞因子TNF-α、IFN-α、IFN-β和IL-4应答水平。临床结果表明：3株代表毒株导致水貂出现不同程度的临床症状和多系统器官的病理学损伤；SDZC(17)M2、Hebei和LNDL(17)M4组致死率分别为80%、20%和0。病毒毒力和免疫抑制水平结果表明：SDZC(17)M2、Hebei和LNDL(17)M4组对水貂毒力和免疫抑制分数分别为2/2.67、1.1/2、0.8/1.73。病毒RNA载量检测结果表明：3株CDV毒株均能在体内靶器官内有效增殖，SDZC(17)M2感染组在肺、淋巴结和肾中的病毒RNA载量最高可达109copies/mL，显著高于Hebei和LNDL(17)M4组(P＜0.05)。SDZC(17)M2感染组水貂在第14天眼鼻和直肠拭子中病毒RNA载量均显著高于其它2组(P＜0.05)。试验还发现3株毒株感染水貂3~10天TNF-αmRNA转录水平下调，第14天mRNA转录水平恢复正常；在3~10天，而IFN-α和IFN-βmRNA转录水平没有明显变化，第14天IFN-α和IFN-βmRNA转录水平上调；在3~21天，IL-4mRNA转录水平下调。3株毒株在表达水貂SLAM的BHK细胞系(BHK-minkSLAM, BMS)上生长曲线分析表明，SDZC(17)M2变异株的合胞体数(68 )和病毒含量(105.4TCID50 )均显著高于LNDL(17)M4和Hebei毒株合胞体数(32和27)和病毒含量(104.3TCID50和104.1TCID50)((P＜0.01；P＜0.001)。
为了揭示CDV变异株H蛋白I542N和Y549H位氨基酸突变是否影响与水貂SLAM/Nectin-4受体相互作用，本研究利用定点突变技术，构建了SDZC(17)M2H蛋白N542I和H549Y位氨基酸单突变及双突变真核表达质粒。免疫共沉淀试验结果显示：Y549H突变增强了与水貂SLAM受体相互作用，而未改变与水貂Nectin-4受体相互作用，我们推测CDVHY549H突变可能增强与水貂SLAM受体的亲和力。
本研究中，我们也验证了首次报道的SDZC(17)M2变异株F蛋白保守的切割位点R223K位氨基酸突变对水貂SLAM/Nectin-4的融合效率，细胞融合及双荧光素报告基因试验结果显示，新发现的F蛋白R223K位氨基酸突变未改变与水貂SLAM/Nectin-4受体的融合效率，推测R223K位氨基酸突变不会影响病毒与受体相互作用。
综上所述，本研究分析了我国山东省CDV变异株与其他毒株在遗传进化、致病性方面的差异性及H、F基因与受体结合区关键氨基酸位点变异对受体结合特性的影响，为深入研究CDV的进化规律、分子致病机制及毛皮动物犬瘟热防控提供了依据。