论文部分内容阅读
肠道菌群与宿主免疫系统之间存在着协同进化关系，黏膜免疫学的发展揭示了肠道菌群在促进宿主免疫系统发育过程中的作用以及免疫系统在维持肠道菌群平衡中的重要作用。B淋巴细胞作为免疫系统中重要的一部分，通常认为其分化、发育过程发生在骨髓或法氏囊中。随着肠道微生物在机体免疫调节过程中发挥着愈发重要的作用，关于肠道微生物的数量和种类是否影响B细胞发育与成熟及其相关机制尚需要进一步阐明。研究证明兔阑尾及绵羊回肠派尔集合淋巴结(Peyer’spatch，PP结)是B细胞发育的初级淋巴器官，此外还发现小鼠小肠固有层是B细胞发育的位点。猪肠相关淋巴组织(GALT)是否是B细胞发育的初级淋巴器官有待进一步揭示。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG， LGG)作为一种模式益生菌，具有很强的肠道定植能力，可以促进肠上皮细胞的增殖、分化以及调节免疫防御和IgA的产生。此外，本实验室已证实LGG可以调节小鼠小肠固有层中早期B细胞和T细胞发育。
B细胞发育过程伴随着编码免疫球蛋白(Ig)重链和轻链的V(D)J基因片段的重组。V(D)J基因的重组需要重组激活基因1/2(RAG1/2)编码的重组酶参与。RAG1和RAG2是两个相邻且相互独立的基因，它们编码的产物作为蛋白质复合体协同发挥功能。RAG1/2基因编码的重组酶可促使Ig和T细胞受体(TCR)的V(D)J基因重组，从而产生B和T细胞初始免疫库的多样性。研究表明，RAG1和RAG2是淋巴细胞V(D)J基因重组所独有的，是早期B细胞和T细胞分化所必需的，并且仅在发育早期的淋巴细胞中表达，而在成熟淋巴细胞中不表达，这一特点使RAG2在研究早期B细胞发育过程中有着重要意义。
首先，本研究合成了猪的RAG2基因，然后克隆到pET-28a载体中构建重组质粒pET-28a-pRAG2，接着把重组质粒转化到大肠杆菌中，使之表达RAG2蛋白，并将蛋白命名为pRAG2，通过亲和层析法纯化获得pRAG2，并免疫兔制备高免血清获取兔抗pRAG2多克隆抗体，并通过westernblot以及免疫荧光验证抗体能够有效的识别猪RAG2蛋白。
其次，把上述所制备的兔抗pRAG2多克隆抗体用荧光染料AlexaFluorTM-488进行标记，用于检测猪的早期B细胞。通过流式细胞术分析发现，在仔猪骨髓和小肠固有层中存在MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞，而在脾脏、肠系膜淋巴结以及PP结中却检测不到。接下来又通过流式细胞术分析发现，在所检测的时间范围内，仔猪肠道固有层中MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞的百分比随着日龄而增加，但在52日龄左右的时候达到高峰，而骨髓中MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞百分比一直在增加。
再次，上述已经发现仔猪肠道固有层中存在MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞，接下来为了检测肠道微生物对仔猪空肠固有层中MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞发育的影响，通过灌胃的方式用1×1010CFULGG干预断奶仔猪连续15天，然后通过流式细胞术分析发现，LGG能够促进肠道中的MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞向更成熟的阶段发育。此外，利用流式细胞术从空肠固有层中分选出MHC-II+CD45RC+CD172a+IgM-早期B细胞进行转录组测序(RNA-seq)以及实时荧光定量PCR分析发现，LGG能够上调氧化磷酸化以及下调细胞周期代谢通路，并且能够上调转录因子FOXO1，RAG1和RAG2的表达，从而进一步证实LGG可以促进早期B细胞发育。
最后，为进一步研究LGG促进仔猪肠道B细胞发育的作用机制。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光以及免疫组库测序分析发现，LGG能够促进肠道SIgA的产生以及影响其抗体多样性的形成。接下来通过磁珠分选出仔猪空肠固有层中IgM+B细胞与克隆表达来源于LGG的p40蛋白进行体外共培养。结果发现，LGG能够通过分泌p40蛋白激活猪肠道上皮细胞(IPEC-J2)EGFR/Akt/NF-κB信号通路使其分泌增殖诱导配体(APRIL)，促进肠道B细胞合成和分泌IgA。此外，通过GST-pulldown、LC-MS/MS和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)分析了与p40相互作用的IPEC-J2细胞膜上的潜在受体(ADP-核糖基化因子4(ARF4)(Q56P20，UniProtKB/TrEMBL)，交联珠蛋白(JUP)(A0A480ME22，UniProtKB/TrEMBL)和A0A480DIF3(DIF3)(A0A480DIF3， UniProtKB/TrEMBL))。
总之，本研究表明LGG能够调节仔猪空肠固有层中B细胞的分化、发育及抗体多样性的形成以及促进B细胞合成和分泌IgA。此外，发现克隆表达来源于LGG的p40蛋白能够通过与IPEC-J2细胞膜上的潜在受体ARF4、JUP或DIF3相互作用激活EGFR以及下游的PI3K/Akt/NF-κB信号通路使其分泌APRIL，从而促进B细胞合成和分泌IgA。本课题为研究猪的B细胞发育以及鼠李糖乳杆菌的作用机制奠定了理论基础。
B细胞发育过程伴随着编码免疫球蛋白(Ig)重链和轻链的V(D)J基因片段的重组。V(D)J基因的重组需要重组激活基因1/2(RAG1/2)编码的重组酶参与。RAG1和RAG2是两个相邻且相互独立的基因，它们编码的产物作为蛋白质复合体协同发挥功能。RAG1/2基因编码的重组酶可促使Ig和T细胞受体(TCR)的V(D)J基因重组，从而产生B和T细胞初始免疫库的多样性。研究表明，RAG1和RAG2是淋巴细胞V(D)J基因重组所独有的，是早期B细胞和T细胞分化所必需的，并且仅在发育早期的淋巴细胞中表达，而在成熟淋巴细胞中不表达，这一特点使RAG2在研究早期B细胞发育过程中有着重要意义。
首先，本研究合成了猪的RAG2基因，然后克隆到pET-28a载体中构建重组质粒pET-28a-pRAG2，接着把重组质粒转化到大肠杆菌中，使之表达RAG2蛋白，并将蛋白命名为pRAG2，通过亲和层析法纯化获得pRAG2，并免疫兔制备高免血清获取兔抗pRAG2多克隆抗体，并通过westernblot以及免疫荧光验证抗体能够有效的识别猪RAG2蛋白。
其次，把上述所制备的兔抗pRAG2多克隆抗体用荧光染料AlexaFluorTM-488进行标记，用于检测猪的早期B细胞。通过流式细胞术分析发现，在仔猪骨髓和小肠固有层中存在MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞，而在脾脏、肠系膜淋巴结以及PP结中却检测不到。接下来又通过流式细胞术分析发现，在所检测的时间范围内，仔猪肠道固有层中MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞的百分比随着日龄而增加，但在52日龄左右的时候达到高峰，而骨髓中MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞百分比一直在增加。
再次，上述已经发现仔猪肠道固有层中存在MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞，接下来为了检测肠道微生物对仔猪空肠固有层中MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞发育的影响，通过灌胃的方式用1×1010CFULGG干预断奶仔猪连续15天，然后通过流式细胞术分析发现，LGG能够促进肠道中的MHC-II+CD45RC+CD172a+RAG2+早期B细胞向更成熟的阶段发育。此外，利用流式细胞术从空肠固有层中分选出MHC-II+CD45RC+CD172a+IgM-早期B细胞进行转录组测序(RNA-seq)以及实时荧光定量PCR分析发现，LGG能够上调氧化磷酸化以及下调细胞周期代谢通路，并且能够上调转录因子FOXO1，RAG1和RAG2的表达，从而进一步证实LGG可以促进早期B细胞发育。
最后，为进一步研究LGG促进仔猪肠道B细胞发育的作用机制。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光以及免疫组库测序分析发现，LGG能够促进肠道SIgA的产生以及影响其抗体多样性的形成。接下来通过磁珠分选出仔猪空肠固有层中IgM+B细胞与克隆表达来源于LGG的p40蛋白进行体外共培养。结果发现，LGG能够通过分泌p40蛋白激活猪肠道上皮细胞(IPEC-J2)EGFR/Akt/NF-κB信号通路使其分泌增殖诱导配体(APRIL)，促进肠道B细胞合成和分泌IgA。此外，通过GST-pulldown、LC-MS/MS和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)分析了与p40相互作用的IPEC-J2细胞膜上的潜在受体(ADP-核糖基化因子4(ARF4)(Q56P20，UniProtKB/TrEMBL)，交联珠蛋白(JUP)(A0A480ME22，UniProtKB/TrEMBL)和A0A480DIF3(DIF3)(A0A480DIF3， UniProtKB/TrEMBL))。
总之，本研究表明LGG能够调节仔猪空肠固有层中B细胞的分化、发育及抗体多样性的形成以及促进B细胞合成和分泌IgA。此外，发现克隆表达来源于LGG的p40蛋白能够通过与IPEC-J2细胞膜上的潜在受体ARF4、JUP或DIF3相互作用激活EGFR以及下游的PI3K/Akt/NF-κB信号通路使其分泌APRIL，从而促进B细胞合成和分泌IgA。本课题为研究猪的B细胞发育以及鼠李糖乳杆菌的作用机制奠定了理论基础。