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鱼类细菌性疾病可导致多种水生动物发病死亡，造成水体环境的污染与公共卫生安全问题。维氏气单胞菌(Aeromonas veronii, A. veronii)能引发鱼类细菌性肠炎等流行性肠道疾病，给水产养殖业造成严重的经济损失，同时该病原菌对人类公共卫生安全或食品安全的影响也不容忽视。目前，抗生素或弱毒苗可通过抑制病原菌或诱导动物抗体产生限制致病菌的传播。但由于耐药菌株的产生及弱毒苗潜在的毒力风险，此类药物或疫苗不能广泛应用。因此，研发能高效诱导局部黏膜免疫反应抵御A.veronii等致病菌侵袭黏膜组织的疫苗逐渐成为研究热点。与哺乳动物相似，鱼类黏膜组织受到病原菌刺激后能产生特异性抗体，在多聚免疫球蛋白受体协助下渗透至黏膜表面的粘液层，介导黏膜组织的免疫清除反应以此维持黏膜组织表面微生物群的平衡。鉴于此，以鱼类黏膜组织作为药物或疫苗作用靶点的策略可应用于新型鱼类疫苗的研究中。乳酸菌能黏附于黏膜组织表面逐步形成定植，与浸泡、注射免疫途径相比，黏膜递呈途径能活化并调节局部黏膜免疫与系统性免疫应答。因此，乳酸菌可作为替代传统的抗原或细菌载体潜在候选之一。
首先，本研究在干酪乳杆菌ATCC393(Lactobacillus casei, L. casei)菌株中筛选出5种高表达基因的启动子，分别为转录延长因子GreA(transcription elongation factor GreA)、磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase)、L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase)、磷酸戊糖变位酶(phosphopentomutase)及丙酮酸水合酶(phosphopyruvate hydratase)，将扩增的启动子与报告基因EGFP串联表达，构建了原核表达载体，以L.caseiATCC393作为表达载体，构建重组乳杆菌Lc/pPG1-nP-EGFP-Tldh，利用免疫印迹、免疫荧光及qRT-PCR方法分析启动子表达蛋白能力。结果显示，成功扩增5种启动子(Ptef、Ppgm、Pldh、Ppm与Peno)且均含有-35区域、-10区域及核糖体结合区域(RBS)；Westernblot检测结果显示5种启动子均能在未诱导条件下使外源基因表达；对不同重组乳杆菌进行免疫荧光分析，结果证实构建的菌株均能产生绿色荧光信号，且荧光信号差异与启动子数量有关；其中，串联5个启动子时，其EGFP荧光信号强度显著高于其他数量启动子的活性，并选择5P-EGFP-Tldh作为乳杆菌候选表达载体；经免疫印迹与qRT-PCR验证显示，携带串联5个Pldh启动子表达载体的乳杆菌中EGFP基因表达水平最佳，进一步证实乳杆菌L-乳酸脱氢酶(Pldh)启动子具有较高的启动活性，可作为乳杆菌载体优良的候选组成型启动子。
其次，将A.veronii浸泡感染乌鳢后进行肠道组织的比较转录组测序，筛选出与肠道适应性免疫或黏膜免疫应答相关的Igs(及其受体)差异表达基因及肠道Igs网络相关信号通路，对乌鳢IgT和pIgR基因进行扩增与鉴定并分析其结构特征，进一步检测黏膜Igs及其受体在肠道等组织中的分布规律。结果表明，经转录组测序发现，感染A.veronii乌鳢的后肠组织中产生大量差异表达基因(DEGs)，GO富集显示多数DEGs参与免疫系统、适应性免疫及Igs介导免疫应答等生物学过程；此外，KEGGpathway富集分析表明，感染乌鳢的后肠组织中趋化因子、B细胞受体及肠道免疫网络分泌IgA等免疫系统相关信号通路显著富集；在此基础上，本研究进一步筛选出IgT与pIgR基因部分同源序列，通过RACE方法获得了2种基因全长(2009 bp、1412 bp)，其中IgT基因编码586个氨基酸，含有1个信号肽与4个典型的Ig-like结构域，进化分析表明乌鳢IgT基因与鳟鱼亲缘关系较近，RT-PCR检测显示，处于稳定期或感染病原后IgT基因在乌鳢后肠等黏膜组织中表达水平较高；pIgR基因共编码335个氨基酸，含有1个信号肽与3个跨膜区，其胞外区由2个蛋白结构域组成(ILD1，ILD2)，进化分析表明乌鳢pIgR基因与牙鲆亲缘关系较近，组织分布检测结果表明感染病原后的乌鳢pIgR基因在各组织中均有表达，但后肠组织中的表达水平最高；经免疫印迹证实，在乌鳢肠粘液中均检测到IgT与pIgR的表达，且IgT可能以多聚体形式存在，而IgM主要表达于血清中；经免疫荧光检测发现，后肠组织中存在IgT+与pIgR+细胞，而头肾中存在较多的IgM+细胞聚集于黑色素巨噬细胞周围或中心。
进而，将构建表达保护性抗原的组成型干酪乳杆菌Lc/pPG1-5Pldh-OmpAI-Tldh经肛门插管途径免疫接种乌鳢，检测重组乳杆菌在乌鳢肠道内的定植能力，并分析后肠组织内免疫相关基因表达水平变化，同时利用免疫沉淀与免疫荧光试验分析重组乳杆菌对乌鳢后肠内B细胞活化及Ig分泌的调节作用。结果表明，重组乳杆菌能在乌鳢肠道中持续定植，在首免后(20 d)与加强免疫后(40 d)肠道内菌落数量约105-106CFU；经RT-PCR检测发现，免疫重组乳杆菌后乌鳢肠道组织中的igt、IL-6、pigr及BCRα基因呈上调表达趋势，且头肾及脾中IL-6与BCRα基因转录水平也得到提升；此外，我们发现免疫接种的乌鳢后肠粘液中分泌了IgT，可能是在pIgR作用下将Ig转运至粘液层；后肠组织及白细胞的免疫荧光观察显示，重组乳杆菌在体内能促进后肠内IgT+与pIgR+细胞的活化，增强IgT的分泌能力。
最后，为探究重组乳杆菌调节鱼类黏膜免疫应答的作用机制及其保护作用，应用重组乳杆菌以加强免疫方案免疫接种乌鳢，经ELISA与免疫荧光等方法检测后肠等组织粘液与血清中特异性抗体滴度，及特异性抗体结合粘液共生菌的能力，进一步分析乌鳢黏膜组织及系统性免疫器官中IgT+与IgM+细胞的增殖情况，并利用RT-PCR检测各组织中免疫相关基因的表达水平；在加强免疫2周后，选择浸泡感染途径进行攻毒保护试验。结果显示，肛门免疫接种重组乳杆菌Lc/pPG1-5Pldh-OmpAI-Tldh能诱导局部黏膜组织Igs反应，并促进后肠、皮肤及鳃粘液中Igs的持续分泌，同时重组乳杆菌也能活化系统性免疫器官的IgM+B细胞；此外，在重组乳杆菌的免疫调节下，乌鳢后肠、皮肤及鳃粘液中IgT包被共生菌的比例升高，这可能与IgT+B细胞或IgT表达水平密切相关，在维持肠道等黏膜组织表面微生物的稳态平衡中发挥重要作用；同时，免疫接种重组乳杆菌也促进了乌鳢后肠组织中产生高水平特异性IgT反应，及系统性免疫器官的特异性IgM反应，也增强了后肠组织中IgT+B细胞的活化与增殖；各组乌鳢感染A.veronii后，重组乳杆菌使乌鳢对A.veronii的感染能产生42.86%的保护，且存活鱼肠道组织内持续产生的IgT或IgT+B细胞与特异性抗体，在鱼类抗细菌感染过程中发挥关键作用。
本研究构建的组成型干酪乳杆菌有助于调节病原菌导致的炎症反应，并能增加黏膜Igs的分泌，作为鱼类疫苗具有潜在的应用价值，乳杆菌可持续定植于鱼类肠道且对水产养殖环境的安全性较高。目前水产领域应用较广泛的免疫途径为注射免疫，然而该免疫途径对鱼类造成的影响较大，如形成肿胀、针孔感染等。利用黏膜免疫位点递呈疫苗的方式为鱼用黏膜疫苗的推广开辟了新道路。基于本研究结果，经黏膜位点接种乳杆菌可实现高效的疫苗或抗原递呈，同时能诱导局部免疫应答与系统性免疫反应抵御病原菌的侵袭，这为鱼类细菌性疾病黏膜载体疫苗的研发及应用提供了基础。
首先，本研究在干酪乳杆菌ATCC393(Lactobacillus casei, L. casei)菌株中筛选出5种高表达基因的启动子，分别为转录延长因子GreA(transcription elongation factor GreA)、磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase)、L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase)、磷酸戊糖变位酶(phosphopentomutase)及丙酮酸水合酶(phosphopyruvate hydratase)，将扩增的启动子与报告基因EGFP串联表达，构建了原核表达载体，以L.caseiATCC393作为表达载体，构建重组乳杆菌Lc/pPG1-nP-EGFP-Tldh，利用免疫印迹、免疫荧光及qRT-PCR方法分析启动子表达蛋白能力。结果显示，成功扩增5种启动子(Ptef、Ppgm、Pldh、Ppm与Peno)且均含有-35区域、-10区域及核糖体结合区域(RBS)；Westernblot检测结果显示5种启动子均能在未诱导条件下使外源基因表达；对不同重组乳杆菌进行免疫荧光分析，结果证实构建的菌株均能产生绿色荧光信号，且荧光信号差异与启动子数量有关；其中，串联5个启动子时，其EGFP荧光信号强度显著高于其他数量启动子的活性，并选择5P-EGFP-Tldh作为乳杆菌候选表达载体；经免疫印迹与qRT-PCR验证显示，携带串联5个Pldh启动子表达载体的乳杆菌中EGFP基因表达水平最佳，进一步证实乳杆菌L-乳酸脱氢酶(Pldh)启动子具有较高的启动活性，可作为乳杆菌载体优良的候选组成型启动子。
其次，将A.veronii浸泡感染乌鳢后进行肠道组织的比较转录组测序，筛选出与肠道适应性免疫或黏膜免疫应答相关的Igs(及其受体)差异表达基因及肠道Igs网络相关信号通路，对乌鳢IgT和pIgR基因进行扩增与鉴定并分析其结构特征，进一步检测黏膜Igs及其受体在肠道等组织中的分布规律。结果表明，经转录组测序发现，感染A.veronii乌鳢的后肠组织中产生大量差异表达基因(DEGs)，GO富集显示多数DEGs参与免疫系统、适应性免疫及Igs介导免疫应答等生物学过程；此外，KEGGpathway富集分析表明，感染乌鳢的后肠组织中趋化因子、B细胞受体及肠道免疫网络分泌IgA等免疫系统相关信号通路显著富集；在此基础上，本研究进一步筛选出IgT与pIgR基因部分同源序列，通过RACE方法获得了2种基因全长(2009 bp、1412 bp)，其中IgT基因编码586个氨基酸，含有1个信号肽与4个典型的Ig-like结构域，进化分析表明乌鳢IgT基因与鳟鱼亲缘关系较近，RT-PCR检测显示，处于稳定期或感染病原后IgT基因在乌鳢后肠等黏膜组织中表达水平较高；pIgR基因共编码335个氨基酸，含有1个信号肽与3个跨膜区，其胞外区由2个蛋白结构域组成(ILD1，ILD2)，进化分析表明乌鳢pIgR基因与牙鲆亲缘关系较近，组织分布检测结果表明感染病原后的乌鳢pIgR基因在各组织中均有表达，但后肠组织中的表达水平最高；经免疫印迹证实，在乌鳢肠粘液中均检测到IgT与pIgR的表达，且IgT可能以多聚体形式存在，而IgM主要表达于血清中；经免疫荧光检测发现，后肠组织中存在IgT+与pIgR+细胞，而头肾中存在较多的IgM+细胞聚集于黑色素巨噬细胞周围或中心。
进而，将构建表达保护性抗原的组成型干酪乳杆菌Lc/pPG1-5Pldh-OmpAI-Tldh经肛门插管途径免疫接种乌鳢，检测重组乳杆菌在乌鳢肠道内的定植能力，并分析后肠组织内免疫相关基因表达水平变化，同时利用免疫沉淀与免疫荧光试验分析重组乳杆菌对乌鳢后肠内B细胞活化及Ig分泌的调节作用。结果表明，重组乳杆菌能在乌鳢肠道中持续定植，在首免后(20 d)与加强免疫后(40 d)肠道内菌落数量约105-106CFU；经RT-PCR检测发现，免疫重组乳杆菌后乌鳢肠道组织中的igt、IL-6、pigr及BCRα基因呈上调表达趋势，且头肾及脾中IL-6与BCRα基因转录水平也得到提升；此外，我们发现免疫接种的乌鳢后肠粘液中分泌了IgT，可能是在pIgR作用下将Ig转运至粘液层；后肠组织及白细胞的免疫荧光观察显示，重组乳杆菌在体内能促进后肠内IgT+与pIgR+细胞的活化，增强IgT的分泌能力。
最后，为探究重组乳杆菌调节鱼类黏膜免疫应答的作用机制及其保护作用，应用重组乳杆菌以加强免疫方案免疫接种乌鳢，经ELISA与免疫荧光等方法检测后肠等组织粘液与血清中特异性抗体滴度，及特异性抗体结合粘液共生菌的能力，进一步分析乌鳢黏膜组织及系统性免疫器官中IgT+与IgM+细胞的增殖情况，并利用RT-PCR检测各组织中免疫相关基因的表达水平；在加强免疫2周后，选择浸泡感染途径进行攻毒保护试验。结果显示，肛门免疫接种重组乳杆菌Lc/pPG1-5Pldh-OmpAI-Tldh能诱导局部黏膜组织Igs反应，并促进后肠、皮肤及鳃粘液中Igs的持续分泌，同时重组乳杆菌也能活化系统性免疫器官的IgM+B细胞；此外，在重组乳杆菌的免疫调节下，乌鳢后肠、皮肤及鳃粘液中IgT包被共生菌的比例升高，这可能与IgT+B细胞或IgT表达水平密切相关，在维持肠道等黏膜组织表面微生物的稳态平衡中发挥重要作用；同时，免疫接种重组乳杆菌也促进了乌鳢后肠组织中产生高水平特异性IgT反应，及系统性免疫器官的特异性IgM反应，也增强了后肠组织中IgT+B细胞的活化与增殖；各组乌鳢感染A.veronii后，重组乳杆菌使乌鳢对A.veronii的感染能产生42.86%的保护，且存活鱼肠道组织内持续产生的IgT或IgT+B细胞与特异性抗体，在鱼类抗细菌感染过程中发挥关键作用。
本研究构建的组成型干酪乳杆菌有助于调节病原菌导致的炎症反应，并能增加黏膜Igs的分泌，作为鱼类疫苗具有潜在的应用价值，乳杆菌可持续定植于鱼类肠道且对水产养殖环境的安全性较高。目前水产领域应用较广泛的免疫途径为注射免疫，然而该免疫途径对鱼类造成的影响较大，如形成肿胀、针孔感染等。利用黏膜免疫位点递呈疫苗的方式为鱼用黏膜疫苗的推广开辟了新道路。基于本研究结果，经黏膜位点接种乳杆菌可实现高效的疫苗或抗原递呈，同时能诱导局部免疫应答与系统性免疫反应抵御病原菌的侵袭，这为鱼类细菌性疾病黏膜载体疫苗的研发及应用提供了基础。